复方唇香草颗粒干预As斑块炎症反应信号通路的实验研究

袁 爽， 伍 倩， 陈 悦， 辛效毅

(新疆医科大学第一附属医院中医内科， 乌鲁木齐 830054)

近年来心脑血管疾病已成为人类的第一杀手，而动脉粥样硬化(As)又是多数心脑血管疾病发生的前期病理基础。As的病理实质是一种炎症反应[1]，是斑块不稳定、发生破裂的中心环节[2]。目前通过抑制炎症反应来延缓患者As的发生发展，特别是稳定斑块、防止破裂，已经成为医学领域的重要研究方向。以维吾尔药为主的复方唇香草颗粒是新疆医科大学第一附属医院中医科根据新疆地域特点和新疆心脑血管疾病发病学特点总结出的经验方，临床疗效显著。本研究通过复方唇香草颗粒对Apo-E基因敲除小鼠As斑块内IκK-β/IκB-α/NF-κB 信号通路的影响，探讨其稳定As斑块作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1动物6～8周龄Apo-E基因敲除小鼠(品系C57BL/6J，北京大学实验动物中心自美国Jackson实验室引进并培育)70只，均为雄性，体质量18～20 g，饲以含脂肪15%、胆固醇2%的高脂饲料(60钴γ灭菌照射处理)，饲养条件为2级，室温保持在22℃～24℃，相对湿度为50%，光照时间为北京时间07∶00～19∶00。

1.2药物、试剂与仪器复方唇香草颗粒(唇香草、脱力草、苦参、红景天、汉防已、葛根)由新疆医科大学第一附属医院制剂室制备，根据临床人拟用量与小鼠剂量转换因子转换的使用剂量为：高剂量组0.318 g/20 g，中剂量组0.159 g/20 g，小剂量组0.080 g/20 g，用蒸馏水配制成0.84 g/mL 浓度混悬液；血脂康片(规格：0.30 g/粒，国药准字Z10950029，北大维信生物科技有限公司)，用蒸馏水配制成0.2 mL/20 g；辛伐他汀片(规格：20 mg/粒；，国药准字H10970385，由默沙东制药有限公司提供)，用蒸馏水配制成1 mL/mg；IκK-β原位杂交试剂盒(北京新生命生物制药有限公司),IκB-α原位杂交试剂盒(北京新生命生物制药有限公司),NF-κB 原位杂交试剂盒(北京新生命生物制药有限公司),浓缩型胃蛋白酶液,3% 柠檬酸溶液,DAB 显色剂；OLYMPUS BH2光学显微镜(日本OLYMPUS公司)，LKB-V切片机(瑞典LKB公司)，SN-695型γ测量仪(上海核子所，日环光电仪器厂),ABI-7300型Real-time检测仪(美国ABI公司)。

1.3方法

1.3.1 模型的建立 Apo-E基因敲除小鼠饲以含脂肪15%、胆固醇2%的高脂饲料(60钴γ灭菌照射处理)，12 w后，随机处死10只，取主动脉根部，HE染色普通光镜下观察，确定As形成。

1.3.2 分组及标本处理 其余小鼠随机分为6组：模型组(生理盐水组)、中药对照组、西药对照组及复方唇香草颗粒高、中、低剂量组，每组各10只。根据成人每日用药临床推荐的常用量，按体质量系数比折算成小鼠用量，药物溶于蒸馏水，灌胃给药，每日1次。喂养12 w后，处死全部小鼠，取出腹主动脉生理盐水冲洗后，立即置入 4 %多聚甲醛(含0.1%的DEPC)固定液固定48 h，待其有一定硬度后，取出动脉，标本按照梯度酒精脱水、浸蜡、包埋，沿横切面将标本连续切片。

1.4原位杂交法检测IκK-β、IκB-α和NF-κBmRNA的表达按照试剂盒说明书进行原位杂交，杂交后细胞核进行常规苏木素染色；石蜡切片常规脱蜡入水；3% 过氧化氢室温反应10 min；3% 柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶室温消化15 min；预杂交液37℃反应2～4 h；杂交液37℃过夜；封闭液37℃反应30 min；生物素化鼠抗地高辛37℃反应60 min；SABC37℃反应20 min；生物素化过氧化物酶37℃反应20 min；DAB 显色5～10 min，必要时苏木素复染，充分水洗；酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片。原位杂交阳性细胞计数：在光学显微镜400倍视野下，分别在内膜、肩区、纤维帽和基底部各选取2个阳性表达比较集中的视野，进行阳性细胞计数，求其平均值。

2 结果

2.1确定As斑块的形成高脂喂养12 w后，HE染色显示小鼠主动脉根部已形成明显的As斑块，内膜明显增厚，内皮下、斑块内有胆固醇结晶，纤维帽形成，确定动脉粥样硬化斑块已形成。

2.2各给药组对小鼠斑块内NF-κBmRNA、IκK-βmRNA、IκB-αmRNA表达的影响与模型组比较，中药对照组、西药对照组及复方唇香草颗粒高、中、低剂量组IκK-β和NF-κB mRNA的表达降低(P<0.01)，IκB-αmRNA的表达增高(P<0.05)；而西药对照组与复方唇香草颗粒高、中剂量组比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 各给药组对小鼠斑块内 NF-κBmRNA、IκK-β、IκB-αmRNA表达的影响

注：与模型组相比，#P<0.01；与中药对照组相比，*P<0.05；与复方唇香草颗粒低剂量组相比，▲P<0.05。

3 讨论

陈孝东等[3]报道As 是一种多发性动脉内膜慢性炎症性疾病。斑块内脂质的沉积可抑制细胞外基质合成、促进斑块内血管新生，在炎症介质诱导下导致斑块破裂出血[4-7]。

NF-κB作为一种转录因子，存在于单核细胞、血管内皮和血管平滑肌细胞中，是调节细胞基因转录的关键因子之一，参与许多与炎症反应有关的基因的表达调控，从而加速了As的发生发展。IκK 是通过激活NF-κB的抑制蛋白IκB的降解而激活 NF-κB的上游激酶。当细胞受到上游刺激因子作用时，NF-κB诱导激酶(NIK)可被激活，NIK 激活IKB激酶(IKK)进一步致使IKB分子磷酸化降解，NF-κB与IKB三聚体解离释放NF-κB，激活NF-κB信号途径。IκK-β/IκB-α/NF-κB信号通路是促炎症基因表达的枢纽之一。NF-κB及IκK-β被激活后，将导致炎症相关因子的过度表达，引起明显的炎症反应。而IκB-α在动脉壁内的含量高低则决定NF-κB及IκK-β mRNA的表达，IκB-α可以抑制NF-κB及IκK-β mRNA的表达，反之则促进其表达，正确调整主动脉壁IκK-β/IκB-α/NF-κB mRNA的表达可有效降低动脉粥样硬化的发生发展，从而降低心脑血管疾病的死亡率。

复方唇香草颗粒是新疆医科大学第一附属医院中医科根据新疆地域特点和新疆心脑血管疾病发病学特点经过几代中医人总结出的以维吾尔药、地产药为主的经验方，在临床上获显著疗效。复方唇香草颗粒中的维吾尔药唇香草又名苏则，维医用于治疗心脏病、胃病等，具有芳香开泄、舒展清阳、强心利湿、理气化痰等功效，唇香草能抑制脂质在动脉内壁的沉积，从而有效地抑制内皮细胞黏附分子-1的表达，具有抑制NF-κB mRNA表达的作用；脱力草又名仙鹤草，具有活血、散痞、强心、活化PPAR-γ的作用；苦参清热燥湿、利尿，有降血脂、抗炎作用；红景天有补气养血、和血化瘀之功，可抑制血管细胞粘附分子-1(ICAM-1)的表达，抑制血管壁炎症细胞的释放；汉防己具有抗心律失常、降血压、抗心肌缺血之功，可活化PPAR-γ，减少炎症介质和细胞因子的产生和释放；葛根具有扩张血管、促进血液循环和降压、降脂作用。诸药合用共奏益气活血、升阳利湿、祛瘀化浊之功，减缓动脉粥样硬化炎症反应程度，降低心脑血管事件的发生率。

本研究显示，与模型组相比，复方唇香草颗粒高、中、低剂量组及西药对照组、中药对照组小鼠主动脉壁IκK-β及NF-κBmRNA的阳性表达均有不同程度的降低；与中药对照组及复方唇香草颗粒低剂量组相比，复方唇香草颗粒中剂量组、高剂量组及西药对照组有不同程度的降低，提示复方唇香草颗粒和辛伐他汀抗动脉粥样硬化作用可能是通过抑制主动脉壁IκK-β、NF-κB mRNA的表达来实现的；复方唇香草颗粒中、高剂量组及西药对照组小鼠主动脉壁IκB-αmRNA的阳性表达有不同程度的升高，提示复方唇香草颗粒和辛伐他汀均可促进主动脉壁IκB-α水平，从而抑制主动脉壁NF-κB mRNA的表达，发挥其抗动脉粥样硬化作用。

综上所述，复方唇香草颗粒具有抗动脉粥样硬化的作用，其机制可能与抑制NF-kB与IκK-β、提高IκB-αmRNA的表达、调控IκK-β/IκB-α/NF-κB 信号通路的活动而抑制炎症反应有关。

参考文献:

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[2] Libby P. Inflammation in atherosclerosis[J]. Nature,2002,420:868-874.

[3] 陈孝东，王元伟，刘春风．炎症与动脉粥样硬化性脑梗死相关性研究进展[J]．中国误诊学杂志，2008，8(35)：8582-8583.

[4] Papaspyridonos M, McNeill E, de Bono JP, et al. Galectin-3 is an amplifier of inflammation in atherosclerotic plaque progression through macrophage activation and monocyte chemoattraction[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(3):433-440.

[5] Hu CL, Xiang JZ, Hu FF, et al. Adventitial inflammation: a possible pathogenic link to the instability of atherosclerotic plaque[J]. Med Hypotheses, 2007, 68(6):1262-1264.

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[7] Shiner M, Fuhrman B, Aviram M. Macrophage paraoxonase 2 (PON2) expression is up-regulated by pomegranate juice phenolic anti-oxidants via PPAR gamma and AP-1 pathway activation[J]. Atherosclerosis, 2007,185(2):313-321.