高效液相色谱法测定桂蒲肾清胶囊中人参皂苷Rg1含量

何 羽

（贵州省毕节市食品药品检验所，贵州 毕节 551700）

桂蒲肾清胶囊是由诃子、人工牛黄、三七等12味中药组方的复方制剂，具有清热利湿解毒、化瘀通淋止痛等功效。桂蒲肾清胶囊收载于《国家中成药标准汇编·内科肾系分册》[1]，三七为该方中主药，原标准只对其作定了性鉴别而没有含量测定方法，2010年版《中国药典（一部）》对三七测定了人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1三者的总量[2]。由于人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1吸收波长在紫外末端区，含量测定时各成分相互干扰严重，人参皂苷Rb1和三七皂苷R1不易与基线分离，而人参皂苷Rg1为三七的主要成分，与基线和各杂质峰分离较好。为此，采用人参皂苷Rg1为三七的含量控制指标，取得了满意的结果，现报道如下。

1 仪器与试药

SPD－10AVP型高效液相色谱仪（日本岛津公司），LC－10ATVP型检测器；Waters e2695型高效液相色谱仪，2998检测器；AG－135型电子天平（日本岛津公司）。乙腈（色谱纯，江苏汉邦科枝有限公司）；甲醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心）；冰醋酸（天津市永达化学试剂有限公司）；水为重蒸水，自制；人参皂苷Rg1对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号为 110754－200421）；桂蒲肾清胶囊（市场购买，批号为20100501，20100811，20100924）。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：SunfireC18柱（200mm ×4．6mm，5μm）；流动相：乙腈 －0．05% 磷酸水溶液（25 ∶75）[4]；流速：1．0 mL ／min；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。在此条件下，样品中人参皂苷Rg1与其他杂质峰均能达到与基线分离，阴性无干扰，见图1。

2．2 溶液制备

图1 高效液相色谱图

精密称取经60℃减压干燥4 h的人参皂苷Rg1对照品14．52 mg，置100 mL的容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（每1 mL含人参皂苷Rg10．145 2 mg）。

取装量差异项下的本品，研细，取1．0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流提取60 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0．45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。取缺三七的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

阴性干扰试验：精密吸取对照品溶液、阴性对照品溶液及供试品溶液各10 μL，按拟订色谱条件注入高效液相色谱仪。结果在此色谱条件下，在与人参皂苷Rg1峰相同的保留时间处，阴性样品无峰出现，说明阴性对照品溶液无干扰，见图1。

线性关系考察：精密称取经60℃减压干燥4 h的人参皂苷Rg1对照品10．89 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品贮备液（每1mL含人参皂苷Rg10．435 6 mg）。精密量取对照品贮备液精密吸取 1，2，3，4，5，6 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含人参皂苷Rg143．56，87．12，130．68，174．24，217．80，261．36 μg 的系列对照品溶液，分别精密吸取上述系列对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件测定峰面积，记录色谱图，以对照品进样量（X，μg）为横坐标、峰面积值（Y）为纵坐标，得回归方程Y＝472 915．125 28X＋1 269．600 00，R2＝0．999 14（n＝6）。将一样品的峰面积代入上两式，结果RSD为0．33%，可认为截距为零，可用外标一点法计算含量。结果表明，人参皂苷Rg1进样量在0．435 6 ～2．613 6 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验：精密吸取人参皂苷Rg1对照品溶液（质量浓度为 0．145 2 g／L）10 μL，平行进样 6 次，结果的RSD为 0．32%，表明仪器精密度良好。取同一对照品溶液，分别在不同日期、不同分析人员、不同设备分别进行测定。结果不同日期、不同分析人员、不同设备测得的含量RSD为1．17%，表明该含量测定方法的中间精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液各10 μL，在室温下每隔2 h重复进样5次。结果每隔2 h进样的RSD为2．06%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

重复性试验：取同一批次的样品，依法制备5份供试品溶液，按拟订色谱条件测定含量。结果表明，该样品的平均含量为3．397 3 mg／g，RSD为 0．81% （n＝5），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的同一批样品（人参皂苷Rg1含量为 3．200 2 mg ／g）0．5 g，9 份，精密称定，将相当于对照品溶液总含量的80%，100%，120%质量浓度人参皂苷Rg1加入人参皂苷 Rg1贮备液（0．24 g ／L）4，5，6 mL，依法制备成供试品溶液，按照拟订色谱条件测定。结果见表1。

2．4 样品含量测定

依法测定3批样品，每批测定3次，结果见表2。从样品中人参皂苷Rg1测定结果可知，平均含量为每粒1．625 9 mg，但考虑到生产或贮存过程对药品的影响，以本品每粒含人参皂苷Rg1的含量限度按理论下浮25%计为1．625 9 mg×（1－25%）＝1．219 4 mg／粒，与现行药品限量规定要求相符，即含人参皂苷Rg1的含量暂订为含三七以人参皂苷Rg1计不得低于1．25mg／粒。

3 讨论

提取方法考察：取本品2份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量；一份超声处理（功率250 W，频率33 kHz）60 min；另一份回流提取60 min，放冷，再称定质量。用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，用0．45 μm微孔滤膜滤过，取10 μL按拟订色谱条件注入高效液相色谱仪进行试验。结果热回流提取60 min人参皂苷Rg1含量为3．926 1 mg／g，超声提取60 min人参皂苷Rg1含量为3．188 0 mg／g，说明用甲醇热回流提取60 min较超声处理60 min人参皂苷Rg1的含量高。因此，本样品的提取方法选择热回流提取。

表1 人参皂苷Rg1加样回收试验结果（n＝9）

表2 样品含量测定结果（n＝3）

提取时间考察：取本品3份，称取1．0 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流提取30，60，90 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，用0．45 μm微孔滤膜滤过，精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，按拟订色谱条件注入高效液相色谱仪进行试验。结果加热回流提取30 min人参皂苷Rg1含量为3．354 6 mg／g，加热回流提取60 min人参皂苷Rg1含量为3．939 8 mg／g，加热回流提取90 min人参皂苷Rg1含量为3．948 1 mg／g，说明用甲醇加热回流提取60 min和90 min比加热回流提取30 min含量高，但含量比较相近。故本品处理方法定为用甲醇加热回流提取60 min。

静置时间考察：取本品2份，称取1．0g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量；一份静置过夜；另一份未静置；加热回流提取60 min，放冷，再称定质量。用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0．45 μm微孔滤膜滤过，精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL按上述色谱条件注入高效液相色谱仪进行试验。结果静置过夜后人参皂苷Rg1含量为3．936 8 mg／g，未静置的人参皂苷 Rg1含量为 3．940 4 mg／g，说明静置过夜与未静置的人参皂苷Rg1含量相近。故选择未静置过夜。

由于人参皂苷Rg1为紫外末端吸收，笔者设想测定人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1三者的总量，但试验时发现杂质干扰严重，很难达到基线分离与准确定量。笔者用过甲醇－水、甲醇－水－冰醋酸、乙腈－水、乙腈－水－冰醋酸等按不同比例进行考察，结果以乙腈－0．05%磷酸水溶液（25∶75）为流动相分离效果最好，出峰时间最短，且人参皂苷Rg1与杂质峰和基线完全分离，达到含量测定的要求。

[1]WS－10988－（ZD －0998）－2002．国家药品标准[S]．2002：13

[2]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010：10．

[3]苗明三，李振国．现代实用中药质量控控制技术[M]．北京：人民卫生出版社，2000：36 －43．

[4]周自桂，郭 萍．HPLC法测定三七止血分散片中人参皂苷Rg1的含量[J]．江苏药学与临床研究，2006，14（3）：190 －191．