汉麻果胶皂苷类成分分离及其抗真菌活性研究

袁 野，蔡光明

（1．四川文理学院，四川 达州 635000； 2．中国人民解放军第302医院·全军中药研究所，北京 100039）

汉麻Cannabis sativaL Hemp是一年生大麻科植物，又名大麻、寒麻、线麻、火麻、魁麻等，是我国原产作物之一，主要分为纤维用汉麻、药用汉麻和籽用汉麻3种[1]。汉麻全身是宝，其韧皮用于纺织；杆芯用于研磨生产木粉、制造活性炭和造纸；麻叶、麻花、麻根提取的药物，有止血、散瘀、解毒、安胎等功效；麻籽可提取出相当于深海鱼油含量的不饱和脂肪酸；油渣可制取生物柴油[2－3]。汉麻织物有一定的抑制细菌生长作用，通过对汉麻纤维天然抗菌特性的测试分析，发现汉麻纤维对造成人体脚气病和股癣的须癣毛癣菌、红色毛癣菌、犬小孢子菌3种真菌具有显著的抑制效果[4－5]。在汉麻加工过程中，麻农在汉麻浸泡脱胶处理的水溶液中操作时发现，原患有的脚气病不治而愈，且疗效极佳。本课题前期通过系统预试验法确定了汉麻果胶中含有生物碱、黄酮、皂苷、多糖、甾体、萜类、鞣质或酚类、蒽醌类和挥发油等成分[6]，并测定总皂苷的平均含量约为0．36%[7]。本研究中以蕨麻苷Ⅱ为对照品，采用D101大孔树脂对汉麻果胶皂苷成分进行初步分离，并采用微量液基稀释法研究皂苷各洗脱部位对常见致病真菌的体外抗真菌活性，为进一步研究汉麻果胶抗真菌有效部位提供试验依据。

1 仪器、材料与试验菌株

电热数字显示恒温水浴锅（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）；SHZ－95型循环水式多用真空泵（河南省巩义市英峪仪器厂）；R501B型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；AL204型电子分析天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）；回流提取装置（100mL圆底烧瓶、球形冷凝管）。

汉麻果胶干燥粉末（取自鲜茎皮杆分离和干茎皮杆分离时脱下的粉状物质，由总后勤部军用汉麻材料研究中心提供，取材于西双版纳汉麻种植基地）；薄层层析用硅胶G板（青岛海洋化工有限公司）；甲醇、冰醋酸、醋酐、盐酸、氢氧化钠、乙醇均为分析纯；D101型大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司）；蕨麻苷Ⅱ（2α，3β，19β－三羟基 －乌苏酸 －28－O－β－D－吡喃半乳糖苷，由解放军第302医院中药研究所制备并鉴定，经高效液相色谱归一化法计算，纯度大于98%）；芦丁和槲皮素（中国药品生物制品检定所，批号分别为 100080－200306，100081－200406）；马铃薯培养基（PDA）、燕麦培养基、沙氏液基（SDA）（均由北京科昊泽生物技术有限公司提供）。

红色毛癣菌（Trichophyton rubrum，编号01657）、须癣毛癣菌（Trichophyton mentagrophytes，编号 31016）、犬小孢子菌（Microsporum canis，编号 7060）、白色念珠菌（Candida albicans，编号 05556），均由北京大学真菌和真菌病研究中心包藏菌株。

2 方法与结果

2．1 方法

2．1．1 成分提取和分离

取汉麻果胶原料粉末10 g，加入80%乙醇浸泡24 h，置回流加热装置上回流提取3次，加入溶剂量分别为8倍量、5倍量、4倍量，提取时间为每次1．5 h，合并提取液，于旋转蒸发仪上（－0．1 kPa，65～70℃）回收溶剂，至无乙醇味。加入乙醇至含醇浓度为30%（相当于每1 mL中含有0．4 g原生药），静置24 h，过滤，取上清液。上清液经D－101型大孔吸附树脂柱，分别用水及10%，30%，50%，70%，80%，95%乙醇进行梯度洗脱，回收各洗脱部分浓缩至干，分别进行泡沫试验和Liebermann－Burchard反应[8]，以反应是否呈阳性确定皂苷类成分洗脱部位。

取适量皂苷洗脱粉末，溶于5 mL甲醇中，依2010年版《中国药典（一部）》附录ⅥB薄层色谱法试验，各吸取2 μL，分别点于硅胶G薄层板上，展开条件分别为：以蕨麻苷Ⅱ为对照品，以氯仿－丙酮 －甲醇 －甲酸（7∶1∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰；以芦丁和槲皮素为对照品，以氯仿－甲醇－水（65∶35∶20，下层）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%AlCl3乙醇溶液，晾干，置紫外灯下观察。筛选出出现与对照品相应斑点的洗脱部分，作为供试品。

2．1．2 供试品溶液制备

称取洗脱物各6．4 mg，溶于2 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配制成质量浓度为3 200 μg／mL的溶液，经0．22 μm的过滤器除菌后，保存在4℃冰箱备用。用RPMI－1640培养基稀释50倍后，再进行倍比稀释成2倍终浓度，质量浓度由高到低依次为64，32，16，8，4，2，1，0．5，0．25，0．125，0．06 μg ／mL。分别将各质量浓度的药物加入96孔细胞培养板中，每孔100 μL。1～10列为药物各浓度，11列为生长对照，12列为空白对照以及溶剂对照。

2．1．3 菌悬液制备

皮肤癣菌经PDA培养基活化，红色毛癣菌经燕麦培养基活化，取菌溶于2 mL 0．9%氯化钠注射液中，待沉降后，取上清液比浊仪计数为 0．5麦氏浊度（相当于 1×105～5×105CFU ／mL），用RPMI－1640培养基稀释100倍，得最终菌悬液浓度为1×103～5×103CFU／mL；白色念珠菌经SDA培养基活化后，取上清液比浊仪计数为 0．5麦氏浊度（1×106～5×106CFU ／mL），用 RPMI－1640培养基稀释2 000倍，得最终菌悬液浓度为 0．5×103～2．5 ×103CFU ／mL。

2．1．4 接种

设置溶剂对照组和空白对照组。分别将各菌悬液100 μL接种于配制好的药敏板中，35℃温箱培养。

2．1．5 结果判定

皮肤癣菌4～6 d观察结果，白色念珠菌24～48 h观察结果。在不搅动情况下肉眼判断，溶液清晰透明视为真菌完全不生长，取完全不生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

2．2 结果与分析

2．2．1 成分分离试验

结果见表1和图1。由表1可知，乙醇浓度为50%以上的各洗脱部分对皂苷类专属试验均呈阳性，说明50%以上浓度的乙醇可将皂苷成分洗脱下来。而30%以下的洗脱液呈阴性，这可能由于其中所含皂苷成分较少，可溶性杂质含量较多，因此在试验中，可作为除杂溶液。

表1 各洗脱部分定性结果

图1 70%和80%洗脱部分薄层色谱法检识图

由图1可见，汉麻果胶提取物在经D101大孔树脂分离纯化后，虽然70%和80%的洗脱液对皂苷类试验均呈阳性，但所含的皂苷类成分存在一定的差异，其中80%洗脱液在展开条件下，在相应位置出现与对照品溶液相同的蓝色斑点，这说明该洗脱部位含有与对照品结构相同或相类似的成分，但70%洗脱液尽管增加点样量，并未出现类似斑点。70%洗脱液经展开剂展开后置紫外灯下观察，呈现较多的黄色荧光斑点，并出现与两对照品溶液相近比移值斑点，而前期试验测定显示70%乙醇洗脱液中黄酮类成分的含量大约为50%，说明该部位含有较多的黄酮类成分，高于皂苷类成分的含量；相反，80%洗脱液未出现明显的荧光斑点，表明其中含有较少的黄酮类成分，这与已有的试验结果一致[9]，同时含量测定试验也显示，该洗脱部位的皂苷类成分高于黄酮类成分的含量[10]。

2．2．2 抗真菌试验

汉麻果胶洗脱物的MIC结果见表2。根据美国临床和实验室标准协会起草的M－27P方案规定，MIC不大于32 μg／mL时，认为其对真菌具有敏感性。由表2可见，80%洗脱物对须毛癣菌、红色念珠菌、犬小孢子菌均有较好的抑制作用，其MIC分别为16，8，2 μg／mL，其中对犬小孢子菌的抑菌效果最好，这可能与其中含有的大量的皂苷类成分有关；70%洗脱物仅对犬小孢子菌具有一定的抑制作用，其MIC为16 μg／mL，但由于该洗脱部分中含有大量的黄酮类成分，因此无法确定其是否为皂苷类成分起作用。两洗脱部分对白色念珠菌均未表现出明显的抑菌作用。从以上分析结果可知，70%和80%乙醇洗脱物具有不同的生物活性，抗真菌有效部位为后者。

表2 汉麻果胶70%和80%洗脱物的 MIC（μg／mL，n＝3）

3 讨论

真菌病是一种感染性皮肤病，发病率高，病原菌种类繁多，临床上根据致病菌种类不同，可分为浅部真菌感染和深部真菌感染。目前临床上常用的抗真菌药物可分为多烯类、唑类、棘白霉素类等，然而致病真菌对抗真菌药物耐药性问题日趋凸显，给临床治疗带来很大的困难。中药抗真菌剂具有来源广泛、毒副作用小、广谱、药效长等优点，可在真菌细胞内产生多方面的药理效应，很少出现耐药，适合于长期及预防性应用。体外试验表明，从天然产物中分离提取的黄酮类、醌类、酰胺类、羧酸类、生物碱、萜类、甾体类、酚类和醛类等成分具有一定的抗真菌作用。在对汉麻果胶进行全化学成分分析之后，为确定汉麻果胶抗真菌有效部位和有效成分，本课题组首先研究皂苷类成分。由于尚未见有关汉麻果胶对照品的相关报道，因此在研究皂苷类成分时需要寻找合适的对照品，经过反复薄层色谱分析发现，80%乙醇洗脱物经氯仿－甲醇（85∶15）展开剂展开后，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热显色后，在相应位置出现与本试验室制备的蕨麻苷Ⅱ相同的蓝色斑点，因此在研究汉麻果胶皂苷成分时选取蕨麻苷Ⅱ作为对照品。

在利用大孔树脂分离纯化汉麻果胶提取物时，以蕨麻苷Ⅱ作为对照品对各洗脱部分进行薄层色谱检识，结果发现70%浓度的乙醇始终无法将该类成分洗脱下来，而当洗脱浓度增加至80%时，洗脱液中才出现该斑点，且从这两部分洗脱液薄层色谱分析结果来看，两者所含皂苷类成分存在明显的不同，同时结合已有的含量测定结果，上柱时分别采用水、30%乙醇进行除杂，再分别用浓度70%和80%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集得到的80%浓度的洗脱液中皂苷类成分和黄酮类成分可实现初步分离。另一项体外研究表明[10]，70%乙醇洗脱物具有广谱的抗细菌作用，因此该洗脱工艺也能达到将具有不同生物活性的有效部位进行分离的目的。

目前本课题组综合各种化学手段已从70%乙醇洗脱物中分离得到是nemerosin、香草醛、滨蒿内酯、芦丁等7种化合物[11]，在今后的工作中，本课题组将采用硅胶柱色谱、薄层色谱制备等方法对抗真菌部位进行分离鉴定，筛选出抗真菌有效成分，从而为研发出一种能够有效治疗皮肤浅部真菌感染的中药新药外用制剂提供科学依据。

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