片球菌素BM-1免疫蛋白对甘露糖磷酸转移酶受体识别特异性研究

周万里，张京声，张世湘，郝彦玲

(中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京100083)

0 引 言

乳酸菌细菌素的抑菌范围不局限于近缘菌，也可杀死和抑制食品中的一些腐败菌和病原菌[1]。细菌素进入人体后能够被消化道内各种蛋白酶消化，低毒、无副作用。IIa类细菌素对单增李斯特氏菌具有强的抑制作用，因此对IIa类细菌素抑菌机制的研究成为热点[2-3]。

甘露糖磷酸转移酶系统IICD组分是IIa类细菌素的受体，细菌素结合受体，破坏细胞膜完整性，导致细胞死亡[4-6]。细菌素的同源免疫蛋白与受体-细菌素复合物的相互作用阻止细菌素对细胞的致死作用[6-8]。然而，免疫蛋白与受体结合的具体机制尚未阐述清楚。本研究在乳酸乳球菌中分别表达植物乳杆菌来源的mptIICD、肠膜明串珠菌来源的ptlIICD与免疫蛋白pedB，抑菌实验结果表明免疫蛋白在与受体结合中存在特异性识别。

1 实 验

1.1 材料

(1)菌株和质粒。产细菌素菌株植物乳杆菌BM-1分离自产于福建省的发酵鱼制品，对细菌素敏感的植物乳杆菌WQ0815和肠膜明串珠菌05-43、乳酸乳球菌NZ9000及质粒pNZ8148由本实验室保存。质粒pNZ8148的遗传图谱如图1所示。

图1 质粒pNZ8148的遗传图谱

(2)培养基和试剂。植物乳杆菌和肠膜明串珠菌培养采用MRS培养基，乳酸乳球菌培养采用GM17培养基。限制性内切酶、T4DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶和DNA Marker；质粒提取试剂盒；其他常规化学试剂均为国产分析纯。

(3)引物合成。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及用途如表1所示。

表1 引物序列及用途

1.2 方法

1.2.1 对片球菌素BM-1敏感菌株的筛选

细菌素制备：活化后的植物乳杆菌BM-1发酵液以1%的接种量接种于1L MRS的液体培养中，37℃培养24 h，6 000 r/min离心15 min，收集上清液。将发酵上清液调至pH值为6.0，置于磁力搅拌器上，缓慢加入硫酸铵至最佳质量分数70%。4℃放置2 h后6 000r/min离心15 min，弃上清，将沉淀重悬于浓度为0.1 mol/L磷酸钠缓冲液中，离心除去残留的不溶物，0.22 μm滤膜除菌得到细菌素溶液。

抑菌实验采用牛津杯法[9]：以实验室保存20株乳酸菌为目标菌株，利用牛津杯法筛选对细菌素敏感的乳酸菌。

1.2.2 载体pNZmptIICD和pNZptlIICD的构建

对于乳酸菌表达载体pNZmptIICD构建，首先以植物乳杆菌WQ0815基因组为模板，利用引物mptⅡCD-F和mptⅡCD-R扩增甘露糖磷酸转移酶系统酶ⅡCD组分的编码基因mptⅡCD，采用NcoI和XhoI分别双酶切PCR产物和载体pNZ8148，将酶切后的PCR产物和载体在T4-DNA连接酶的作用下进行连接。连接产物电转化入乳酸乳球菌NZ9000，将其涂布于含氯霉素(5 μg/mL)的MRS平板上，30 ℃培养48 h。 将得到的携带mptⅡCD基因的重组质粒命名为pNZmptIICD。对于乳酸菌表达载体pNZptlⅡCD的构建，载体构建策略与pNZmptⅡCD相同。首先以肠膜明串珠菌05-43的基因组为模板，利用引物ptlⅡCD-F和ptlⅡCD-R扩增甘露糖磷酸转移酶系统酶IICD组分的编码基因ptlⅡCD，将其构建到载体pNZ8148，将得到的携带ptlIICD基因的重组质粒命名为pNZptlIICD。

1.2.3 载体pNZmptB和pNZptlB的构建

以植物乳杆菌BM-1的基因组为模板，利用引物pedB-F和pedB-R扩增免疫蛋白编码基因pedB，利用XhoI和XbaI双酶切pedB的PCR产物，在T4-DNA连接酶的作用下分别与经XhoI和XbaI双酶切回收的载体pNZmptIICD和pNZptlIICD进行连接，将得到的携带mptIICD和pedB基因的重组质粒命名为pNZmptB，携带ptlIICD和pedB基因的重组质粒命名为pNZptlB。

1.2.4 重组菌株对片球菌素BM-1的敏感性检测

采用牛津杯法，以各重组菌株 (携带空载质粒pNZ8148的乳酸乳球菌(NZ9101)、携带质粒pNZmptIICD的乳酸乳球菌(NZ9104)、携带质粒pNZptlIICD的乳酸乳球菌(NZ9113)、携带质粒pNZmptB的乳酸乳球菌 (NZ9106)及携带质粒pNZptlB的乳酸乳球菌(NZ9114))为指示菌，检测这些菌株对片球菌素的敏感性。

2 结果与分析

2.1 对片球菌素BM-1敏感的乳酸菌筛选

以实验室保存的20株乳酸菌为出发菌株，利用牛津杯法筛选对片球菌素敏感的乳酸菌。实验结果表明植物乳杆菌WQ0815和肠膜明串珠菌05-43对片球菌素BM-1敏感(图2)。

图2 WQ0815和05-43的敏感性分析

2.2 载体pNZmptIICD和pNZptlIICD的构建

以植物乳杆菌WQ0815基因组为模板扩增mptIICD基因，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测可见一条约1.8kb的条带，与预期大小相符。将NcoI和XhoI双酶切回收的mptIICD基因和pNZ8148载体进行连接，重组质粒pNZmptIICD经PCR鉴定获得预期大小1.8kb的目的片段，经NCBI/Blast比对确定目的片段与植物乳杆菌ST-III中IICD的同源性达99%。证明携带mptIICD基因的乳酸菌表达载体构建成功(图3)。同时以相同的方法获得携带ptlIICD基因的乳酸菌表达载体pNZptlIICD(图4)。

图3 重组质粒pNZmptIICD的PCR鉴定

图4 重现质粒pNZptlIICD的PCR鉴定

2.3 载体pNZmptB和pNZptlB的构建

以植物乳杆菌BM-1基因组为模板进行PCR扩增pedB基因，经1%琼脂糖凝胶电泳检测可见一条约300 bp的扩增条带，与预期大小相符。将XhoI和XbaI双酶切回收的pedB基因分别和经XhoI和XbaI双酶切回收的pNZmptIICD、pNZptlIICD载体进行连接。重组质粒pNZmptB和pNZptlB经PCR鉴定获得预期大小300bp的目的片段，经DNAMAN比对确定目的片段与植物乳杆菌BM-1中片球菌素BM-1同源免疫蛋白的同源性达100%。证明携带pedB基因的乳酸菌表达载体构建成功(图5)。

图5 重组质粒pNZmptB和pNZptlB的PCR鉴定

2.4 免疫蛋白与受体相互作用的验证

首先对两种不同来源的受体在宿主乳酸乳球菌中的有效性进行验证。由图6可知携带空载质粒pNZ8148的乳酸乳球菌(NZ9101)对片球菌素BM-1不敏感，而携带质粒pNZmptIICD和pNZptlIICD的乳酸乳球菌 (NZ9104和NZ9113)对片球菌素BM-1敏感，实验结果表明植物乳杆菌中WQ0815的mptIICD和肠膜名串珠菌05-43的ptlIICD在NZ9000中表达可作为片球菌素BM-1的受体，使得对片球菌素BM-1不敏感的NZ9000对片球菌素BM-1敏感。

由图6同时可知携带重组质粒pNZmptB的乳酸乳球菌(NZ9106)对片球菌素BM-1不敏感，而携带重组质粒pNZptlB的乳酸乳球菌 (NZ9114)对片球菌素BM-1敏感。结果说明：免疫蛋白在NZ9000中表达后可识别植物乳杆菌的甘露糖磷酸转移酶IICD组分mptIICD，同时结合片球菌素BM-1，三者结合形成免疫蛋白-受体-细菌素复合物，阻止细菌素的抑菌作用，导致宿主菌对片球菌素BM-1产生抗性；而免疫蛋白不识别肠膜明串珠菌的甘露糖磷酸转移酶IICD组分ptlIICD，从而导致宿主菌对片球菌素BM-1敏感。

图6 重组菌株的敏感性分析

3 结 论

目前，对IIa类细菌素抑菌机制的研究主要集中在细菌素、受体及免疫蛋白三者的相互作用。IIa类细菌素N端β折叠区域特异性识别位于甘露糖磷酸转移酶系统IIC组分N端的胞外环，两者结合形成的复合物导致细胞膜出现致死孔洞[10，11]。在产细菌素菌株胞内，免疫蛋白通过识别细菌素-受体复合物阻止细菌素的抑菌作用，而免疫蛋白与细菌素的识别作用表现出高度的特异性[8,12,13]。本文重点研究免疫蛋白和受体的特异性识别情况，首先分别在乳酸乳球菌NZ9000中诱导表达两种不同来源的甘露糖磷酸转移酶系统IICD组分，抑菌实验结果表明这两种受体可识别结合片球菌素BM-1。进一步在乳酸乳球菌NZ9000中诱导表达植物乳杆菌WQ0815来源的IICD组分mptIICD和免疫蛋白pedB，抑菌实验结果表明：免疫蛋白pedB可识别片球菌素BM-1与mptIICD组分，形成复合物免疫蛋白-片球菌素-mptIICD，阻止片球菌素BM-1的抑菌作用。在乳酸乳球菌中诱导表达肠膜明串珠菌05-43来源的IICD组分ptlIICD和免疫蛋白pedB，抑菌实验结果表明：免疫蛋白不能识别ptlIICD组分，导致复合物片球菌素-ptlIICD杀死细胞。研究结果证明了免疫蛋白对受体存在特异性识别，为免疫蛋白与受体作用的进一步研究奠定了基础。

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