微波辅助法提取银杏叶总黄酮的研究*

毛龙火 王丽丽 熊 英

(1南昌大学第一附属医院传染科 江西南昌 330031;2九江学院基础医学院 江西九江 332000)

银杏 (Ginkgo bilobal)系银杏科植物，具有欣赏、经济、药用等多种价值。近年来，银杏叶的药用价值备受关注，引得广大学者去研究探讨。已发现的银杏叶化学提取物有上百种，其中主要有黄酮类、萜类、酚类、生物碱等，而近年来的研究表明:黄酮类物质是银杏叶的主要有效成分。黄酮类化合物的结构特点是具有C6－C3－C6的基本骨架，根据中间三碳链的氧化程度、B环(苯基)连接位置 (2－或3－位)以及三碳链是否呈环状等特点，分为许多类型:黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、二氢异黄酮、查尔酮等化合物［1］。现已证实，银杏叶中含有的黄酮类化合物具有优异的抗氧化活性、抗肿瘤活性、防治心血管疾病和增强免疫力等作用。正是其上述众多的生物活性引起了人们的广泛重视，对该类化合物的研究已成为国内外医药界研究的热门课题，是一类具有广泛开发前景的天然药物［1］。

目前提取黄酮化合物的主要方法有有机溶剂提取法、水或热水提取法、微波提取法、二氧化碳超临界提取法、酶解法、超声波提取法等［1］。有机溶剂提取排污量大;水或热水提取法效率低;氧化碳超临界提取法、酶解法成本较高［2］;微波提取法设备简单，提取效率高，是一个比较好的提取方法［3］。因此，本实验用微波辅助有机溶剂法提取银杏叶中总黄酮，以了解微波辅助下各种因素对银杏叶总黄酮提取效率的影响，最后经聚酰胺纯化，为进一步研究银杏叶的后期应用奠定基础。

1 材料与方法

1实验材料

1.1.1 实验药物 实验所用银杏叶购自九江天天好大药房。

1.1.2 标准对照品 芦丁标准品 (中国生物制品检定所，批号100080－200707)配制成0.25mg/mL的芦丁标准液。

1.2 试验方法与结果

1.2.1 芦丁标准品溶液的制备 精确称取干燥至恒重的芦丁对照品10.0mg于50mL容量瓶中，用适量70%乙醇溶解、蒸馏水定容。作为浓度为0.2mg/mL的芦丁标准品溶液备用。

1.2.2 银杏叶总黄酮样品溶液制备 先把银杏叶粉碎、干燥，称取银杏叶粉末1g，按比例加入一定浓度乙醇作溶剂，置于微波设备中提取浓缩，提取液过滤，加30%的乙醇溶解定容于50mL，摇匀静置备用。

1.2.3 测定吸光度波长的选择 分别取适量的芦丁标准品溶液和制备好的银杏叶总黄酮溶液，加入30%的乙醇至20mL，加入5%的NaNO21mL，摇匀静置6min，加10%Al(NO3)31mL，摇匀静置6min，再加入10%的NaOH 10mL，并加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置15 min后使用双光束紫外可见分光光度计测最大吸光度，测得上述两种溶液在511.2nm处有最大吸收波长。因此，本研究中将511.2nm作为最大吸收波长。

1.2.4 标准曲线的制备 分别取已制备好的芦丁标 准 品 溶 液 0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL于50mL容量瓶中，先后各自加入30%乙醇至25mL，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6min，加入10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min［4］，加入10%氢氧化钠10mL，加水至刻度，摇匀，放置15min［5］。在511.2nm波长测定吸光度，以芦丁标准品溶液浓度 (C)为横坐标，吸光度 (A)为纵坐标，建立芦丁标准品浓度 (C)与吸光度 (A)的标准曲线，并绘制A－C标准曲线 (如图1)，最后得回归方程为:C=87.536×A—0.7994R2=0.9997。

图1 芦丁标准曲线

1.2.5 黄酮的定性鉴别［6］

(1)盐酸－镁粉反应:取已制备好的银杏叶总黄酮样品1mL置加有镁粉适量的试管中，加浓盐酸数滴，在泡沫处呈红棕色。

(2)荧光反应:①三氯化铝:将样品点在纸上，喷洒1%(或5%)AlCl3，干燥后黄色斑点于紫外荧光灯下观察，显黄色斑点。②浓氨水溶液:将样品点在纸上，干燥后，将滤纸在浓氨水瓶上熏，立即置于荧光下呈现极明显的黄色荧光斑点［5］。

1.2.6 银杏叶总黄酮的纯化

(1)聚酰胺的预处理:取聚酰胺适量用4倍体积量95%乙醇浸泡48h，用超纯水洗至中性;然后用4倍体积量的0.5%NaOH浸泡24h后再用水洗至中性;最后再用10%乙酸浸泡24h，用水洗至中性。

(2)总黄酮的纯化:称取已处理好的聚酰胺200g装入层析柱中，将银杏叶提取液约400mL以2～3mL/min的流速上柱，过柱完后用3倍聚酰胺体积量 (3～4BV)的超纯水以3～4mL/min的速度洗柱至出水无色，再用4BV70%的乙醇以2～3mL/min的洗脱速度洗脱至无色透明，收集70%的乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，称重，测定总黄酮含量。

1.2.7 单因素实验 将已制备好的银杏叶总黄酮样品溶液放在双光束紫外可见分光光度计检测，并根据回归方程求出黄酮得率:黄酮得率 (%)=黄酮含量×稀释倍数×稀释体积×10－3/(W×103)×100%。选取对提取率有影响的3个因素:微波加热时间、乙醇浓度、料液比，进行单因素实验，获得各个因素下的最佳提取条件。

(1)微波加热时间对黄酮得率的影响: 分别称取银杏叶粉1g，加入20mL浓度为70%的乙醇，按上述方法提取黄酮，分别提取1、2、3、4、5min，计算黄酮得率并作微波加热时间—黄酮得率图，确定最佳的微波加热时间为3min。

(2)乙醇浓度对黄酮得率的影响: 按上述方法提取黄酮，加入20mL不同浓度的乙醇溶液(50%、60%、70%、80%、90%)，在微波设备中提取一定时间 (为确定的最佳微波加热时间)，计算黄酮得率并作乙醇浓度—黄酮得率图，确定最佳的乙醇提取浓度为70%。

(3)料液比对黄酮得率的影响: 按上述方法，分别加入不同体积 (10mL、15mL、20mL、25mL、30mL)最佳浓度的乙醇溶液提取黄酮，计算在不同料液比下银杏叶的黄酮得率并作乙醇体积—黄酮得率图，确定最佳的料液比为20mL［7］。1.2.8正交实验 在单因素实验的基础上，以黄酮含量为考察指标，采用L9(33)正交表对上述3个因素进行正交实验。为了证实最佳提取条件，对正交实验得到的最佳提取条件进行验证实验［7］。

表1 正交因素和水平

表2 正交实验结果

由表可以看出K1、K2、K3表示各因素分别3个水平时相应的实验结果的算术平均值;极差R是K1、K2、K3中最大值与最小值之差，它反映了实验中各因素影响的大小［8］。所以可知因素A的极差最小，为最小误差项，并且各因素在微波法提取银杏叶总黄酮中的影响程度大小为:乙醇浓度＞料液比＞提取时间。

表3 微波法正交实验设计的方差分析

由正交结果分析可知，因素B乙醇浓度，随着浓度的逐步升高，总黄酮的得率也逐步提高;因素C料液比对总黄酮提取有显著性意义;因素A对提取率无显著性意义，可根据生产条件任取一水平，从节约能源和提高生产效率方面考虑，提取时间选择A1(3min)，得出最佳提取工艺为A1B3C3。

1.2.9 最佳组合的验证 最佳组合实验验证情况见表4。

表4 最佳组合验证

结果表明，验证试验结果与正交试验结果相近，确定该实验结果基本稳定可靠。

微波法与众多其他提取方法相比，具有更方便、快速的优点，但目前，微波萃取的应用对象还比较少，其应用研究还处于初始阶段［9－10］。因此，在提取过程中也出现了不足之处，比如微波提取时间不宜过长，否则由于溶剂溢出造成实验失败。

聚酰胺具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，还可以重复利用既节约，又环保。但本实验未在聚酰胺纯化前、后对细胞影响作出对比，以证明聚酰胺的纯化效果。

2 结论

以银杏叶总黄酮提取液在511.2nm波长处的吸光度为参考指标，通过总黄酮提取工艺的正交试验研究，确定了从银杏叶中提取黄酮的最佳条件为:以90%乙醇为溶剂，料液比为1∶25，微波5min，通过验证性试验确定该提取方法结果准确可靠［8］。为进一步研究银杏叶中总黄酮提取工艺提供理论依据。因此，含有丰富黄酮的银杏叶，具有广泛开发和利用的价值，值得综合利用，应该加强其资源开发［4］。

［1］张岩，曹国杰，张燕，等．黄酮类化合物的提取以及检测方法的研究进展 ［J］．食品研究与开发，2008，29(1):154．

［2］张萏，徐雅晴，时阳．黄酮类化合物提取工艺研究 ［J］．食品与药品，2007，9(04A):54．

［3］张孝武．超声和热碱提取对芦丁成分影响的比较 ［J］．中草药，1997，28(2):88．

［4］谢茵，王秋亚，毕小平．正交设计法探讨生姜中总黄酮的提取方案 ［J］．山西医科大学学报，2008，39(11):1012．

［5］韦耀东，孙婷婷，刘海花，等．超声波提取桑葚总黄酮及鉴别 ［J］．时珍国医国药，2012，23(11):2811．

［6］蔡定建，柳茶花，钟鸿鸣．野菊花中黄酮类物质的提取和鉴定 ［J］．中国食品添加剂，2010，21(2);143．

［7］付明，任宝红，牛友芽，等．超声波辅助法提取藜蒿黄酮的工艺研究 ［J］．怀化学院学报，2009，28(8):40．

［8］李宁，李楚．银杏叶总黄酮提取工艺的正交设计研究 ［J］．山西农业大学学报:自然科学版，2010，30(1):74．

［9］郭振库，金钦汉．微波萃取技术 ［J］．分析科学学报，2001，17(6):505．

［10］陈斌，南庆贤，吕玲，等．微波萃取葛根总异黄酮的工艺研究 ［J］．农业工程报，2001，17(6):123．