实时定量PCR 技术检测BCR-ABL 水平在异基因造血干细胞移植治疗慢性粒细胞白血病中的应用

冯术青 宋旭东 高峰 李晓宇

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一种累及造血干细胞的恶性骨髓增生性疾病，其细胞遗传学特征为可检出费城染色体，分子生物学特点为可检出BCR-ABL 融合基因［1］。CML 患者的BCR-ABL 融合基因重排及其异常表达可影响细胞信号转导途径，导致粒细胞凋亡障碍，在CML发病过程中扮演重要角色［2-3］。BCR-ABL 的表达水平反映了患者体内白血病细胞的负荷量［4］。因此，精确检测BCR-ABL 水平，对CML 的临床分型诊断、个体化治疗方案的制定、治疗效果监测、缓解后复发风险的评估、治疗后残留白血病细胞的检测以及早期干预治疗等方面具有重要的指导作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

研究纳入河北联合大学附属医院血液科2005 年5 月至2013 年5 月接受异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)治疗的CML 患者15 例。其中，男性13 例，女性2 例，中位年龄32 岁(10 ～46 岁)。慢性期患者8 例，加速期患者3 例，急变期患者4 例。患者一般临床资料见表1，急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD)分级按照美国Fred Hutchinson 癌症研究所标准分为Ⅰ～Ⅳ级［2］。慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus host disease，cGVHD)按照Sullivan 文献标准分为局限型与广泛型［5］。随访截止时间2014 年3 月，中位随访时间41 个月(2 ～101 个月)。

1.2 方 法

1.2.1 标本采集

分别在治疗前和治疗后1，2，3，6，12 个月采集15 例CML 患者骨髓血2 ～4 mL(其中1 例患者接受allo-HSCT 治疗后第2 个月死亡，故未在后续时间点采集)，骨髓血标本放入抗凝真空采血管中迅速混匀，4 ℃储存，24 h 内检测。

表1 15 例CML 患者一般临床资料

1.2.2 实时定量PCR(real time quantitative PCR，qRT-PCR)检测BCR-ABL 水平

Trizol 试剂(美国Invitrogen 公司)提取标本总RNA，相关引物序列及探针选择按照Beillard 等［6］报道的方法设计并合成。按照秦亚溱等［7］报道的方案在ABI Prism 7500 PCR 系统(美国ABI 公司)中进行BCR-ABL mRNA 检测。根据标准曲线分别计算标本中ABL 及BCR-ABL 的拷贝数，如果ABL 拷贝数≥3 ×104，即认为该标本合格。按照公式计算BCR-ABL 水平:BCR-ABL 水平(%)= (BCR-ABL拷贝数/ABL 拷贝数)×100%

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0 统计软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差)表示。两组间均数比较采用t 检验。P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同分期CML 患者allo-HSCT 前、后的BCR-ABL水平

检测8 例慢性期及7 例进展期(加速期+急变期)CML 患者在allo-HSCT 前、后不同时间点的BCR-ABL 水平发现，慢性期及进展期患者在allo-HSCT 前 平 均BCR-ABL 水 平 分 别 为(10. 120 ±6.035)%及(43.750 ±14.173)%，差异具有统计学意义(t= －2.289，P ＜0.05)。allo-HSCT 后第1，2，3，6，12 个月，慢性期与进展期患者平均BCR-ABL水平分别比较，差异均无统计学意义(t = －1.936，－ 2. 003，－ 0. 687，－ 1. 613 和－1.171，P 均＞0.05)。慢性期与进展期患者治疗组内各时间点的平均BCR-ABL 水平具有统计学差异(F =2.645 和4.591，P ＜0.05)。allo-HSCT 后12 个月，8 例慢性期患者的BCR-ABL 水平均为0，7 例进展期患者中有5 例为0。详见表2。15 例患者总体生存12 例，死亡3 例。其中，慢性期患者存活7 例，死亡1 例;进展期患者存活5 例，死亡2 例。

表2 不同分期CML 患者allo-HSCT 前、后不同时间点BCR-ABL 水平(%，¯x±s)

注:CML.慢性粒细胞白血病;allo-HSCT.异基因造血干细胞移植

2.2 CML 患者allo-HSCT 后早期干预性治疗情况

15 例CML 患者中，6 例慢性期患者及1 例加速期患者allo-HSCT 后BCR-ABL 水平持续下降，于术后3 个月时降至0，故未行干预治疗。除1 例慢性期患者于allo-HSCT 后4 个月因肺部真菌感染死亡外，其余6 例未接受干预治疗的患者在随访截止时均无病生存。此外，1 例急变期CML 患者在allo-HSCT 后2 个月死于aGVHD(胃肠型)，故未接受复发评估和干预治疗。

allo-HSCT 后出现BCR-ABL 水平升高或者下降缓慢者，被认为具有高复发风险，应实施早期干预性治疗。按此标准，共7 例CML 患者(慢性期患者2 例，进展期患者5 例)接受早期干预性治疗，详见表3。对于在allo-HSCT 后3 个月内出现BCR-ABL水平高表达或呈进行性升高的患者，给予单纯口服伊马替尼;对于3 个月后出现以上情况或单纯口服伊马替尼治疗效果欠佳者，则采用减少或停用免疫抑制剂的干预手段。接受早期干预性治疗的患者均未出现aGVHD、cGVHD 以及重度骨髓抑制等不良反应。除1 例急变期CML 患者在allo-HSCT 后12 个月复发，行再次移植无效而死亡外，其余6 例接受早期干预性治疗的患者均达完全分子生物学缓解，至随访截止时均无病存活。

表3 7 例CML 患者allo-HSCT 后早期干预治疗情况

3 讨 论

qRT-PCR 技术于1996 年由美国Applied Biosystems公司推出，是一种将常规PCR 与探针杂交技术融为一体的新型核酸定量技术。qRT-PCR 工作原理是在PCR 扩增时加入1 个特异性的荧光探针，每扩增1 条DNA 链，就有1 个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步［8］。目前应用最广泛的探针是Taqman 探针。TaqMan 探针法简单易行、特异性强、假阳性率低、线性关系好，已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、基因表达、突变和多态性研究等多个领域［6］。qRT-PCR 实现了核酸检测从定性到定量的飞跃，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快以及全封闭反应等优点，适用于CML 治疗后微小残留病灶(minimal residual disease，MRD)的监测［9］。

MRD 定义为:CML 患者初诊时，体内白血病细胞的数量约为1 ×1012个，经过治疗达到完全缓解后，体内残留有1 ×106～1 ×108个白血病细胞，是导致疾病复发的最根本原因［10］。所以，在CML 患者治疗过程中及完全缓解后精确监测MRD，对选择强化治疗时机、化疗强度和维持治疗的时间以及判断预后、早期干预性治疗等方面都具有重要意义，并且能够极大地提高CML 患者的缓解率及长期无病生存期。

初诊CML 患者往往在3 ～5 年慢性期后进入加速期乃至急变期，此时常伴有BCR-ABL 水平的上升，因此疾病进程中监测该基因具有重要作用［11］。国内外许多学者应用qRT-PCR 对BCR-ABL 水平进行定量测定，探讨BCR-ABL 水平与CML 进展的关系，及其在预后判断和动态监测MRD 中的作用。吕晓东等［12］应用qRT-PCR 检测324 例CML 患者518 份标本的BCR-ABL 表达情况，发现从慢性期进入加速期和急变期CML 患者的BCR-ABL 逐渐增高，分别为12.6%，25.4%和57.2%(P ＜0.05);治疗后患者BCR-ABL 水平随时间延长逐渐降低，一般在6 个月后降至0。本研究结果显示相比进展期CML 患者，慢性期CML 患者在allo-HSCT 前BCRABL 水平较低，差异具有统计学意义(P ＜0.05);同时发现，allo-HSCT 治疗后发生分子生物学缓解的患者BCR-ABL 定量结果持续下降，与国内外文献报道类似［13-15］。

有学者均认为allo-HSCT 后3 ～5 个月可通过qRT-PCR 检测BCR-ABL 水平预测白血病复发［16］，但该法能否预测MRD 的发生一直存在争议。Hagop 等［17］发现CML 患者BCR-ABL 水平呈增加趋势或持续高水平可预示复发。Elmaagacli 等［18］发现，BCR-ABL 水平在CML 的不同分期有显著差异。秦亚溱等［7］报道治疗后各时间段均有一定数量的CML 患者可检测出BCR-ABL。许兰平等［19］认为BCR-ABL 水平具有以下特点的CML 患者复发风险较低:(1)allo-HSCT 治疗后1 个月内较治疗前下降至少2 个对数级以上;(2)allo-HSCT 治疗后2 ～3 个月内持续下降或保持在低水平;(3)allo-HSCT治疗后4 ～6 个月内降低，直至检测不出。本研究中，6 例慢性期CML 患者及1 例加速期CML 患者的BCR-ABL 水平在allo-HSCT 治疗后1 ～3 个月内持续下降，并于3 个月以后持续为0，故均未行早期干预性治疗，临床上也无复发，患者均长期存活。该结果提示仅检测治疗后3 个月的BCR-ABL 水平临床意义不大，这与Heaney 等［20］报道相一致。因此，通过qRT-PCR 动态检测CML 患者allo-HSCT 治疗后的BCR-ABL 水平有助于筛选出无需进行复发干预的患者，可使复发干预更具针对性，从而提高CML 患者无病生存率。

CML 患者治疗后出现复发或复发风险的干预治疗措施包括减少或停用免疫抑制剂，以及采用以伊马替尼为代表的酪氨酸激酶抑制剂。减少或停用免疫抑制剂可以使复发患者达到持久的分子生物学缓解，可使70% ～80%的慢性期患者获得持久疗效，而对进展期CML 患者有效率则很低，早期应用往往伴随骨髓抑制和严重的移植物抗宿主病［21］。伊马替尼短期疗效显著，但早期应用的安全性以及停药后是否能使患者继续保持分子生物学缓解还存在争议［22］。许兰平等［23］分析64 例接受allo-HSCT的CML 患者资料，根据BCR-ABL 检测结果在治疗后进行了早期干预性治疗，方案为免疫调节、单独使用伊马替尼及免疫调节与伊马替尼联合使用。结果显示，3 种方案可以达到相似的疗效，但不良反应不同，应权衡并进行个性化选择。

综合本研究结果，我们认为qRT-PCR 动态检测BCR-ABL 水平可及时、准确地预知CML 患者疾病状态。allo-HSCT 治疗后前3 个月，由于患者的造血及免疫功能未得到稳定重建，应尽量采用药物而非免疫调节控制疾病复发。但药物仅在短期有较好作用，长期疗效需要在患者达到造血及免疫功能稳定重建后采用免疫调节手段，可有效减少相关并发症的发生，进一步提高患者的长期生存率。由于本研究病例数较少，尚需扩大样本量以更好地完善CML患者接受allo-HSCT 治疗后的早期干预性治疗体系，以进一步提高患者无病生存率。

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