刀豆素A诱导人乳腺癌细胞自噬性死亡及其机制

陈弘磊 姜 凯 浙江省立同德医院检验科 杭州 310012

刀豆素A诱导人乳腺癌细胞自噬性死亡及其机制

陈弘磊 姜 凯 浙江省立同德医院检验科 杭州 310012

目的探讨刀豆素A对人乳腺癌细胞MCF-7的杀伤作用及其机制。方法采用MTT法检测不同浓度ConA（concanavalin A）处理MCF-7细胞后，MCF-7细胞的增殖情况，并检测自噬标记蛋白LC-3Ⅱ，加入自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）后再检测MCF-7细胞对ConA的敏感性。利用基因沉默技术，抑制BNIP3的表达，再检测ConA处理后MCF-7细胞的增殖和自体吞噬。结果ConA可显著抑制MCF-7细胞的增殖（P＜0.01），并诱导其发生自噬性死亡。ConA处理后MCF-7细胞的BNIP3显著增高（P＜0.05，P＜0.01），利用小RNA抑制BNIP3的表达后，ConA对MCF-7的增殖抑制作用降低（P＜0.01），并抑制了ConA诱导的自体吞噬效应。结论刀豆素A通过上调BNIP3的表达诱导人乳腺癌细胞发生自噬性死亡。

刀豆素A；MCF-7；自体吞噬；BNIP3

乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，其发生率和死亡率仅次于肺癌。手术、化疗、放疗等手段虽然可以使患者获得较高的生存率，但长期化疗副反应多，且易产生耐药性。刀豆素A（concanavalin A，Con A）是从刀豆（Jack bean）中提取出来的凝集素。它是四聚体球蛋白，分子量102，000。每个亚基含237个氨基酸残基，分子量25，500，结合一个Ca2+和一个Mn2+，含一个糖结合部位。能与α-甘露糖、α-葡萄糖（细胞膜糖蛋白上）专一地结合[1]。它是一种经典的T细胞丝裂原，能激活淋巴细胞并浸润至肿瘤组织，杀死肿瘤细胞，且能直接诱导肿瘤细胞死亡[2-3]。自噬性死亡是近年来发现的不同于凋亡的Ⅱ型程序性死亡，以出现过量的自噬小体为主要特征，当自噬形成时，胞浆型LC3（LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II的蛋白表达量可估计自噬水平的高低。自体吞噬可以被3-甲基腺嘌呤所抑制[4]。Bcl2/腺病毒E1B相互作用蛋白3（Bcl-2/adenocar-cinoma E1B19KD interacting protein 3，BNIP3）是包含单BH3区的促凋亡成员，属于BH3-only亚家族，研究表明BNIP3在细胞死亡的传导途径中有十分重要的作用，当BNIP3表达显著增加时，细胞将发生过度的自体吞噬并进入自噬性死亡[5-6]。本实验研究刀豆素A对人乳腺肿瘤细胞MCF-7的杀伤作用，并探讨其杀伤肿瘤细胞的机制是否通过表达BNIP3，引起肿瘤细胞发生自噬性死亡。

1 材料与方法

1.1细胞来源 乳腺癌细胞株MCF-7来自于ATCC，由浙江大学医学院提供。细胞培养于含有10%胎牛血清的RPIM-1640培养基。

1.2实验试剂 RPIM-1640培养基购于Gibco公司；胎牛血清（FBS）购于杭州四季青生物工程有限公司；刀豆素A（concanavalin A，ConA）、噻唑蓝（MTT）、3-甲基腺嘌呤、LC3-Ⅱ多克隆抗体购于美国Sigma公司；细胞裂解液、β-actin单抗和BNIP3多克隆抗体购自美国Cell signal公司；PVDF膜购于Millipore（USA）；转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；BNIP3 siRNA及无关对照siRNA定制于上海吉玛公司；BNIP3的siRNA序列为：正向：5’-CACGAGCGUCAUGAAGAAAUU-3’，反向：5’-UUUCUUCAUGACGCUCGUGUU-3’。

1.3MTT法检测ConA对MCF-7细胞抑制作用 将MCF-7细胞按 1×104/孔接种于 96孔板， 加入200μL含10%FBS的RPIM-1640培养，设置3个复孔，并分别加入0（用磷酸缓冲液PBS代替）、10、20、40μg/mL的ConA培养24h。另设一组加入3mM的3-MA培养1h，然后再加入40μg/mL的ConA培养24h。24h后加5mg/mL MTT 20μL，继续培养4h。弃上清，往孔中加150μL DMSO，震荡使紫色絮状物完全溶解，570nm波长下用酶标仪检测OD值，细胞生长的抑制率以以下公式计算：抑制率=（ODPBS-ODConA）/ODPBS×100%。

1.4Western blot检测不同浓度ConA对MCF-7细胞自噬相关蛋白的表达 在MCF-7细胞培养瓶中分别加入0（用PBS代替）、10、20、40μg/mL的ConA培养24h，同时另设一组在培养瓶中先加入3mM的3-MA培养1h，然后再加入40μg/mL的ConA培养24h，然后取细胞裂解后做western blot检测LC3-II和BNIP3的表达，目标蛋白表达量由它们在胶片上显色后的灰度与相应β-actin的灰度比表示。

1.5BNIP3 siRNA基因沉默检测ConA对MCF-7细胞的影响 按照Lipofectamine 2000操作说明书在MCF-7培养体系中分别加入100nM的BNIP3 siRNA以及无关对照siRNA培养16h，之后加40μg/ mL ConA再培养24h，检测细胞的增殖和自噬程度。

1.6统计学方法 所有实验重复3次，实验数据使用SPSS11.0统计软件进行处理，P值计算采用非配对双边t检验以及单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1刀豆素A对乳腺肿瘤细胞MCF-7的抑制作用

与未加ConA的PBS组比较，MCF-7细胞在不同浓度ConA的作用下均呈现出抑制效应，且呈剂量依赖性（P＜0.01）。而MCF-7细胞用自噬抑制剂3-MA预处理后再加ConA培养，ConA对MCF-7细胞的抑制作用相比于未用3-MA预处理组明显减弱（P＜0.01），提示刀豆素A通过诱导肿瘤细胞过度的自体吞噬效应杀伤肿瘤细胞，见表1。

表1 不同浓度刀豆素A对MCF-7肿瘤细胞的抑制作用（）

表1 不同浓度刀豆素A对MCF-7肿瘤细胞的抑制作用（）

注：与PBS组比较，**P＜0.01；与不加3-MA的40μg/mL ConA组比较，△△P＜0.01

2.2刀豆素A对乳腺肿瘤细胞MCF-7自体吞噬的诱导效应 与未加ConA的PBS组比较，MCF-7细胞在不同浓度ConA的作用下LC3-Ⅱ和BNIP3的表达均明显升高。而MCF-7细胞用3-MA预处理后再加ConA培养，LC3-Ⅱ的表达相比于未加3-MA组显著减少（P＜0.05），而BNIP3的表达则不受影响（P＞0.05）。进一步说明刀豆素A能诱导乳腺癌肿瘤细胞发生自体吞噬，见表2。

表2 不同浓度刀豆素A对MCF-7肿瘤细胞蛋白表达的影响（）

表2 不同浓度刀豆素A对MCF-7肿瘤细胞蛋白表达的影响（）

注：与PBS组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与40μg/mL ConA组比较，△△P＜0.01

组别PBS组10μg/mL ConA组20μg/mL ConA组40μg/mL ConA组40μg/mL ConA+3mM 3-MA组n/孔3-MA浓度/mM 33333 ConA浓度/（μg/mL）0 10 20 40 40 00003灰度比（LC3-Ⅱ/β-actin）0.01±0.01 0.24±0.05** 0.52±0.14** 0.73±0.12** 0.38±0.13**△△灰度比（BNIP3/β-actin）0.20±0.07 0.29±0.10* 0.61±0.18** 0.84±0.14** 0.80±0.15**

2.3BNIP3表达对刀豆素A发挥抗肿瘤效应的影响 用BNIP3 siRNA沉默BNIP3的表达后，与加无关siRNA的对照组相比，ConA对MCF-7细胞的抑制作用明显降低（P＜0.01），同时ConA诱导的自体吞噬效应也明显降低（P＜0.01）。说明刀豆素A通过上调BNIP3的表达诱导MCF-7细胞发生自体吞噬而导致肿瘤细胞死亡，见表3。

表3 BNIP3 siRNA对刀豆素A发挥抗肿瘤效应的影响（）

表3 BNIP3 siRNA对刀豆素A发挥抗肿瘤效应的影响（）

注：与ConA+无关siRNA组比较，**P＜0.01

组别ConA+无关siRNA组ConA+BNIP3 siRNA组n/孔33 ConA浓度/（μg/mL）40 40 BNIP3 siRNA/nM 0 100无关siRNA/nM 100 0灰度比（BNIP3/β-actin）0.89±0.17 0.38±0.12**灰度比（LC3-Ⅱ/β-actin）0.65±0.14 0.33±0.13**抑制率/% 81.5±7.2 42.3±4.3**

3 讨 论

近年研究发现，ConA能引起一种新型的程序性死亡方式-自体吞噬。自体吞噬过程是一个吞噬自身细胞质蛋白并使其包被进入囊泡的过程，受一系列自噬相关基因的调控，研究发现很多促自噬因子都能抑制癌症发生，相对的，一些自噬负调节因子促进肿瘤的发生。这些分子是直接通过调节自噬来影响肿瘤发生还是通过另外的信号通路影响肿瘤目前仍不清楚。高度自噬能诱发肿瘤细胞死亡，自噬缺失会使某些组织器官（如乳腺、前列腺等）对代谢性应激敏感性增加，易于使DNA受到损伤，诱发肿瘤的发生[7]，自体吞噬与肿瘤细胞的生存和增殖密切相关。本研究通过3-MA抑制了刀豆素A引起的MCF-7细胞的自噬及杀伤活性，证实了ConA通过诱导人乳腺癌细胞发生高度自噬，并诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡。

Bcl-2家族成员在凋亡过程中扮演重要角色，所有的 Bcl-2成员都至少具有四个同源结构域（BH1-BH4）中的一个，这些结构域的不同组合决定其是诱导还是抑制凋亡。BNIP3是包含单BH3区的促凋亡成员，属于BH3-only亚家族，研究表明BNIP3在细胞死亡的传导途径中有十分重要的作用，它的高度表达能诱导非凋亡性的程序性死亡即自噬性死亡[8]。因此提高肿瘤细胞BNIP3的表达有可能起到治疗肿瘤的作用，探索并开发具有提高BNIP3表达的天然药物，在肿瘤治疗方面具有广阔的前景，刀豆素A正是一种天然药物，它不但能增强机体的免疫功能对抗肿瘤，而且还能直接杀伤肿瘤细胞，本文的研究为刀豆素A抗肿瘤治疗的应用提供了实验和理论依据。

［1］Wang HX，Liu M，Weng SY，et al.Immune mechanisms of Concana-valin A model of autoimmune hepatitis［J］.World J Gastroentrol，2012，18（2）：119-125.

［2］Liu B，Min MW，Bao JK.Induction of apoptosis by Concanavalin A and its molecular mechanisms in cancer cells［J］.Autophagy，2009，5（3）：432-433.

［3］Liu Z1，Luo Y，Zhou TT，et al.Could plant lectins become promising anti-tumour drugs for causing autophagic cell death［J］.Cell Prolif，2013，46（5）：509-515.

［4］Parganlija D，Klinkenberg M，Jendrach M，et al.Loss of PINK1 Impairs stress-Induced Autophagy and Cell Survival［J］. PLoS One，2014，9（4）：e95288.

［5］Ishihara M，Urushido M，Hamada K，et al.Sestrin-2 and BNIP3 regulate autophagy and mitophagy in renal tubular cells in acute kidney injury［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2013，305（4）：F495-509.

［6］ Wang EY，Gang H，Kirshenbaum LA，et al.p53 mediates autophagy and cell death by a mechanism contingent on Bnip3［J］.Hypertension，2013，62（1）：70-77.

［7］Green DR，Levine B.To Be or Not to Be How Selective Autophagy and Cell Death Govern Cell Fate［J］.Cell，2014，Mar 27，157（1）：65-67.

［8］Gustafsson AB.Bnip3 as a dual regulator of mitochondrial turnover and cell death in the myocardium［J］.Pediatr Cardiol，2011，32（3）：267-274.

修回日期：2014-06-15

Effect of Concanavalin A Induced Autophagic Cell Death in Breast Cancer Cells and the Mechanism

CHEN Honglei，JIANG Kai. Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the effect of concanavalin A on proliferation of MCF-7 cells and the underlying mechanism.MethodsMCF-7 cells were treated with different concentrations of concanavalin A and then the proliferation of MCF-7 was detected by MTT method and LC-3II was labeled.3-MA was added to detect the sensitivity of MCF-7 cells to concanavalin A.After silencing the expression of BNIP3 with small RNA，the proliferation and autophagy of MCF-7 cells treated with concanavalin A were detected.ResultsConcanavalin A signifi cantly inhibited the proliferation of MCF-7 cells（P＜0.01）and induced autophagic cell death.The expression of BNIP3 significantly increased in MCF-7 cells when treated with ConA（P＜0.05，P＜0.01）.After silencing BNIP3 with small RNA，the effect of inhibition and autophagy of concanavalin A decreased in MCF-7 cells.ConclusionConcanavalin A can induce autophagic cell death of MCF-7 cells via upregulating the expression of BNIP3.

concanavalin A；MCF-7；autophagy；BNIP3

2014-04-30

注：本文第一作者系浙江中医药大学在职研究生