牛奶中高分子质量蛋白致敏作用的初步研究

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牛奶中高分子质量蛋白致敏作用的初步研究

侯丽英1朱黎娜1李 婵2林书祥2刘堂喻亨1尹 悦1李会强1△

目的 探讨牛奶中高分子质量蛋白在牛奶过敏过程中的致敏作用。方法选取牛奶过敏患者血清30例，皮肤点刺试验阳性，血清特异性IgE（sIgE）检测结果均为阳性且≥1+。健康对照血清1例，血清sIgE检测阴性，无过敏史。空腹采血，收集血清于-20℃冻存备用。利用Sephadex G200凝胶层析获得牛奶高分子质量蛋白，通过蛋白免疫印迹法（Wetern blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测高分子质量蛋白与牛奶过敏患者血清sIgE的结合活性。结果SDS-PAGE显示Sephadex G200凝胶层析纯化得到的高分子质量蛋白主要包括3条带，分子质量约为67、80和160 ku，推断其可能是牛血清白蛋白、乳铁蛋白和免疫球蛋白。经Western blot分析，3种高分子质量蛋白与牛奶过敏患者血清均能反应，并且在67 ku附近条带最明显。经ELISA分析，高分子质量蛋白与牛奶过敏患者血清的阳性反应率比β-乳球蛋白略高（分别是46.7％、43.3％）。结论牛奶中高分子质量蛋白组分能够诱导特异性抗体产生，这些组分在牛奶过敏过程中具有重要的致敏作用。

食物过敏；免疫球蛋白E；免疫印迹法；酶联免疫吸附测定；牛奶；高分子质量蛋白；致敏作用；特异性IgE

食物过敏是一个日益严重的健康问题，在西方国家约6％的儿童对食物过敏[1]。牛奶是最常见的八大食物过敏原之一，也是婴幼儿饮食最早添加的食物之一[2]。牛奶过敏能够诱导儿童发生不良反应，可涉及多器官多系统，其临床表现复杂多样，轻重不一，不及时干预会影响儿童的生长发育[3]。目前，除了回避过敏原，还没有合适的治疗牛奶过敏的方法[4]。牛奶蛋白组分大约包括25种不同的蛋白质[5]，理论上绝大多数的牛奶蛋白都具有潜在的免疫原性。但是酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是牛奶中主要的过敏原，50％～65％的牛奶过敏患者对其过敏[6]。而目前对高分子质量蛋白（60～170 ku）的致敏性研究很少。本课题组的前期研究表明用Sephadex G200分离乳清蛋白时所收集的首个洗脱峰与牛奶过敏患者的阳性血清存在反应[7]。因此，本研究应用凝胶层析技术获得高分子质量蛋白组分，再利用蛋白免疫印迹法（Wetern blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测过敏患儿血清特异性IgE（sIgE）的反应性，以评估这些蛋白的致敏活性，为研制高质量的牛奶过敏原检测试剂盒提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器 垂直板型电泳仪、半干转印电泳仪和凝胶成像仪均购自美国BIO-RAD公司；蛋白电泳材料十二烷基磺酸钠、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺、甘氨酸、蛋白Marker、碱性磷酸酶（Ap）标记的羊抗人-IgE、辣根过氧化物酶（HRP）标记的鼠抗人-IgE、四甲基联苯胺（TMB）、β-乳球蛋白纯品等均购自美国Sigma公司；硝酸纤维素膜购自美国PALL公司；凝胶层析填充材料Sephadex G200购自瑞典Pharmacia公司；96孔酶标反应板为美国康宁公司产品。

1.2 血清来源 血清标本均取自天津市儿童医院。阳性血清30例来自牛奶过敏患者，其中男15例，女15例；年龄8个月～5岁，平均4岁±1个月；皮肤点刺试验阳性，血清sIgE检测结果均为阳性且≥1+。阴性血清1例来自健康体检者，血清sIgE检测阴性，无过敏史。空腹采血，收集血清于-20℃冻存备用。

1.3 方法

1.3.1 制备脱脂奶 新鲜牛奶100 mL冷冻离心（4℃）3 000 r/min共15 min，拨开上层脂肪，吸出脱脂乳，双层纱布过滤后，获得脱脂奶。

1.3.2 凝胶层析初步分离脱脂奶 取1.3.1中制备的牛奶蛋白粗提液进行Sephadex G200凝胶层析，调整蛋白浓度为5～10 g/L。常规处理Sephadex G200凝胶并装柱，平衡缓冲液为0.01 mol/L PBS pH7.4，紫外检测洗脱液蛋白浓度，凝胶层析收集各蛋白峰，监测到4个洗脱峰，第1个峰为高分子质量蛋白，其他3个峰为小分子蛋白，分别收集。

1.3.3 蛋白组分分析 采用SDS-PAGE分析高分子质量蛋白，选择分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％，脱脂奶上样浓度约6 g/L，高分子质量蛋白上样浓度约为0.7 g/L，购买的β-乳球蛋白浓度约为2.5 g/L，100℃水浴处理5 min。电泳条件：浓缩胶为65 V恒压，分离胶为135 V恒压。电泳结束后，用凝胶成像仪拍照分析。

1.3.4 IgE Western blot试验 牛奶高分子质量蛋白组分经SDS-PAGE分离后，15 V恒压干转30 min，将蛋白转移到PVDF膜上，用2％聚乙烯醇（PVA）4℃封闭过夜。从30例阳性血清中选取10例（1∶10）做一抗，用1例阴性血清做阴性对照，一抗4℃过夜。洗涤后加二抗（1∶300），37℃孵育2 h，洗涤后加底物液，37℃孵育10 min后终止反应。

1.3.5 ELISA检测过敏原特异性抗体 采用间接ELISA法检测牛奶高分子质量蛋白与30例阳性血清sIgE的结合情况，同时与牛奶主要过敏原β-乳球蛋白做比对。分别用牛奶高分子质量蛋白组分和β-乳球蛋白包被96孔板，加入100 μL（1∶10稀释）阳性血清和阴性血清，混合后37℃孵育2 h，洗涤5次后100 μL二抗（1∶2 000稀释），37℃孵育30 min，洗涤5次后加入底物溶液，避光显色15 min后加终止液终止反应，并测定450 nm处的吸光度值（A450）。如测定孔A450＞2.1倍阴性对照A450则为阳性反应，如测定孔A450＜2.1倍阴性对照A450则为阴性反应。阳性反应率=阳性反应例数/总例数×100％。

2 结果

2.1 Sephadex G200凝胶层析分离 牛奶蛋白粗提液经凝胶层析分离，出现了4个主要的蛋白峰，见图1。第1个峰含有高分子质量蛋白（暂命名为P1），收集并行SDS-PAGE分析。

Fig.1 Atlas of Sephadex G200 gel chromatography of whey protein图1 乳清Sephadex G200凝胶层析图

2.2 P1蛋白组分分析 P1组分主要包括3种高分子质量蛋白，分子质量从小到大依次为67、80和160 ku左右，参照文献[8]推断它们可能依次是牛血清白蛋白、乳铁蛋白和免疫球蛋白，见图2。

Fig.2 SDS-PAGE analysis of milk extracts and HMW proteins图2 牛奶蛋白粗提液和高分子质量蛋白SDS-PAGE分析

2.3 P1组分与牛奶过敏阳性血清Wetern blot结果 10例阳性血清于P1分子质量处均有反应条带，而1例阴性对照没有明显条带。在80 ku和160 ku处出现深浅不一的可辨条带，在67 ku附近条带出现明显条带。以67 ku的阳性条带最为明显,见图3。

2.4 ELISA检测P1组分与牛奶过敏患者sIgE反应结果 P1组分的阳性反应率（46.7％）略高于β-乳球蛋白的阳性反应率（43.3％）。

Fig.3 Immunoblotting analysis of milk HWM proteins图3 牛奶高分子质量蛋白印迹图谱

3 讨论

牛奶过敏是引起婴幼儿及儿童食物过敏的最常见原因[9-10]。大多数的牛奶过敏是由IgE介导的，常用皮肤点刺试验或血清学试验来检测牛奶过敏患者的特异性IgE[11]。因个体差异的因素，不同牛奶过敏患者识别的过敏原也不完全相同。因此，确认牛奶主要过敏原组分尤为重要。

吴序栎等[12]和Pourpak等[13]已经对牛奶过敏原组分进行了分离、纯化和鉴定，但是研究重点是低分子质量蛋白（≤34 ku），并未对牛奶高分子质量蛋白进行研究。本课题组前期对牛奶过敏原组分进行了分离、纯化和鉴定，发现牛奶高分子质量蛋白在牛奶过敏中可能起重要作用。因此，本研究重点对牛奶高分子质量蛋白组分进行了分离和致敏性鉴定。

本研究采用Sephadex G200凝胶层析对牛奶过敏原组分进行了分离，得到的第1个蛋白峰进行SDS-PAGE，结果发现牛奶高分子质量蛋白主要包括3种高分子质量组分，分子质量分别为67、80和 160 ku左右，推断它们可能是牛血清白蛋白、乳铁蛋白和免疫球蛋白。本研究对牛奶高分子质量蛋白的致敏性进行了鉴定。经Western blot分析，3种高分子质量蛋白与牛奶过敏患者血清均呈阳性反应，并且在67 ku附近条带最明显。经ELISA分析，高分子质量蛋白与牛奶过敏患者血清的阳性反应率比β-乳球蛋白略高，充分说明牛奶高分子质量蛋白具有较强的致敏性，也是牛奶中的重要过敏原。

本研究初步证实了牛奶高分子质量蛋白在牛奶过敏中的重要致敏作用，为进一步研发牛奶主要过敏原检测试剂盒和牛奶过敏症的诊治提供了理论基础。在本研究中，是把高分子质量蛋白作为混合物来研究的，后续工作将进一步分离纯化混合蛋白，对单一过敏原组分的致敏性进行研究。

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（2014-04-01收稿 2014-06-25修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Preliminary Research on the Milk Allergy Induced by High Molecular Weight Protein

HOU Liying1,ZHU Li’na1,LI Chan2,LIN Shuxiang2,LIU Tangyuheng1,YIN Yue1,LI Huiqiang1△
1College of Medical Laboratory,Tianjin Medical University,Tianjin 300203,China;2Tianjin Children’s Hospital
△

E-mail:lihuiqiang1965@163.com

ObjectiveTo investigate the allergization of milk high molecular weight proteins.MethodsThirty cases of patients with serum allergic to milk were selected.Their skin prick tests were positive.Resultsof serum specific IgE (sIgE)test were positive and≥1+.One case of healthy control with negative sIgE test and without history of allertgy,was included in this study.The serum samples were collected and frozen at-20℃.Sephadex G200 gel chromatography was used to obtain milk high molecular weight proteins.Western blot and ELISA methodswere used to detect milk high molecular weight proteins and the activity of serum sIgE.ResultsResultsof SDS-PAGE showed that high molecular weights proteins displayed by Sephadex G200 gel chromatography,mainly including three bands,the molecular weight of 67 ku,80 ku and 160 ku.Western blot analysis showed that three kinds of high molecular weights proteins can react with milk allergy serum, and the most obvious appeared near the molecular weight 67 ku band.ELISA analysis showed that the positive response rate of high molecular weight proteins with milk allergic patient’s serum was slightly higher than that of β-lactoglobulin(46.7％ and 43.3％,respectively).ConclusionThe milk high molecular weight protein components can induce specific IgE antibodies,which have important sensitization in the process of milk allergy.

food hypersensitivity;immunoglobulin E;Western blotting;enzyme-linked immunosorbent assay;milk; high molecular weight protein;allergization;specific IgE

R446

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.11.010

国家自然科学基金资助项目（81371882）

1天津医科大学临床免疫检验教研室（邮编300203）；2天津市儿童医院

△通讯作者 E-mail：lihuiqiang1965@163.com