纳豆菌发酵玉米蛋白粉制备玉米肽工艺优化

徐艳阳，朱志红，李晴，唐洋洋，张凌

（吉林大学生物与农业工程学院，吉林长春130022）

纳豆菌发酵玉米蛋白粉制备玉米肽工艺优化

徐艳阳，朱志红，李晴，唐洋洋，张凌

（吉林大学生物与农业工程学院，吉林长春130022）

为了探索玉米肽的制备技术，以玉米蛋白粉为基质，应用纳豆菌发酵法制备玉米肽工艺进行了试验研究。分别对接种量体积分数、玉米蛋白粉质量分数、发酵温度、发酵时间进行了单因素试验研究，采用四因素三水平正交试验设计对玉米肽发酵工艺条件进行了优化，得到最优条件为：发酵温度40℃、发酵时间72 h、接种量体积分数4%、玉米蛋白粉质量分数5%。在此最优条件下发酵，玉米蛋白粉的水解度为11.17%，与理论预测值基本相符。

玉米蛋白粉；玉米肽；纳豆菌；水解度；正交试验

玉米蛋白粉是工业上湿法生产玉米淀粉或酿酒等的主要副产物，其蛋白质含量高达60%～70%，具有极大开发价值[1-2]。但通常被直接用作饲料或随废液自然排放掉，这样不仅浪费了玉米蛋白资源，而且造成环境污染。将玉米蛋白经酶或微生物发酵水解得到的小分子高活性玉米肽，不但易于消化吸收，还具有抗氧化、延缓衰老、增强免疫功能和醒酒、抗疲劳、保肝等多种保健功能[3-5]。因此，为开发利用玉米蛋白粉资源，提高其附加值，制备功能性玉米肽是一种有效途径之一。

微生物发酵法制备活性肽可以减少苦味的产生，降低营养素的损失，适合工业化生产，是一种很有发展潜力的方法。纳豆菌是日本传统发酵食品纳豆的生产菌种，在日本已被使用了两千多年。目前国内学者张智[6]等应用枯草芽孢杆菌ls-45发酵法水解玉米蛋白粉制取了玉米肽。李军军[7]等用米曲霉固态发酵玉米胚芽粕制备玉米肽的研究。刘波[8]等用纳豆菌蛋白酶水解玉米醇溶蛋白抗氧化活性研究。吴泽柱[9-10]从永川豆豉中筛选并驯化出枯草芽孢杆菌，用其水解玉米蛋白粉得到玉米肽。鉴于采用具有较优酶系的纳豆菌发酵制备玉米肽研究较少，因此本文应用纳豆菌对玉米蛋白粉发酵制备玉米肽工艺进行优化研究，为玉米蛋白粉的深加工和工业化发酵生产玉米肽提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

纳豆菌（Bacillus natto）：吉林大学生物与农业工程学院食品微生物实验室提供。

1.1.2 主要原料和试剂

玉米蛋白粉（蛋白质质量分数为61.26%）：长春市大成淀粉厂；蛋白胨、葡萄糖、琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、酚酞、溴麝香草酚蓝、乙醇、甲醛：北京化工厂。

1.1.3 主要仪器

F80型高速粉碎机：金城市金城国胜实验仪器厂；DHP060型恒温培养箱：上海实验仪器厂；LD4-2A型低速离心机：北京市雷勃尔离心机有限公司；DSX-280A型高压蒸汽灭菌锅：上海宜川仪器厂；BS-IE振荡培养箱：国华电器有限公司；JJ200电子天平：常熟市双杰测试仪器厂；PHS-3D精密pH计：上海精科有限公司。

1.1.4 培养基

斜面培养基配方[11]：2.0 g琼脂、2.0 g葡萄糖、1.0 g蛋白胨、0.1 g磷酸氢二钾、0.05 g硫酸镁、100 mL蒸馏水，调节pH至7.0。

种子培养基配方[11]：2.0 g葡萄糖、1.0 g蛋白胨、0.1 g磷酸氢二钾、0.05 g硫酸镁、100 mL蒸馏水，调节pH至7.0。

1.2 方法

1.2.1 纳豆菌悬液的制备

1.2.1.1 纳豆菌的活化

用接种环挑取纳豆菌一环，置于装有10 mL无菌水的试管中充分混匀，制成悬浊液。取少量悬浊液，在斜面培养基平板上涂划线后，置培养箱中在35℃恒温条件下培养24 h～48 h，备用。

1.2.1.2 种子菌悬液的制备

从斜面培养基平板上挑取菌种接入装有100 mL种子培养基的三角瓶中，在37℃、180 r/min的条件下，摇床振荡培养18 h，制成107CFU/mL～108CFU/mL菌液，作为用于发酵玉米蛋白粉的纳豆菌种子液，备用。

1.2.2 玉米蛋白粉的预处理

准确称取1.00 g玉米蛋白粉，加20 mL水浸泡24 h后，120℃蒸煮10 min，取出冷却至一定温度，即得玉米蛋白粉质量分数为5%的发酵原料，备用[12]。

1.2.3 玉米蛋白粉的水解

准确称取质量分数5%发酵原料，接入一定体积分数纳豆菌液，置于培养箱中，在一定温度条件下发酵水解。达到预定水解时间后，取出置100℃水浴中加热10 min灭酶，然后迅速冷却至室温，4 000 r/min离心10 min得上清液，为蛋白水解液。

1.3 玉米蛋白粉水解度（DH）的测定

以水解度为指标，利用甲醛滴定法测定蛋白水解液的水解度[13]。其计算公式如下：

式（1）中：DH为玉米蛋白粉的水解度值；V1为滴定样品消耗氢氧化钠的体积，mL；V2为滴定空白消耗氢氧化钠的体积，mL；V3为发酵液（纳豆菌液和蒸馏水）体积，mL；Mg为玉米蛋白粉中蛋白质的质量，mg；1.400 8为1 mL 0.1 mol/L氢氧化溶液相当的氮量，mg。1.4 单因素及正交试验优化设计

1.4.1 玉米蛋白粉质量分数对玉米蛋白粉水解度的影响

准确称取玉米蛋白粉1.00 g，分别浸入10、20、30、40、50 mL水中浸泡24 h后，120℃蒸煮10 min，取出冷却至一定温度，即得质量分数为10%、5%、3.3%、2.5%、2%发酵原料。接入体积分数3%纳豆菌液，在40℃恒温条件下发酵72 h后，在100℃水浴中加热10 min灭酶，然后迅速冷却至室温，4 000 r/min离心10 min得蛋白水解液，测定水解度。

1.4.2 发酵时间对玉米蛋白粉水解度的影响

按1.2.2操作预处理得到质量分数5%发酵原料后，接入体积分数3%纳豆菌液，在40℃恒温条件下分别发酵24、42、72、96、120 h，达到预定水解时间后，按1.2.3操作，得蛋白水解液，测定水解度。

1.4.3 接种量体积分数对玉米蛋白粉水解度的影响

按1.2.2操作预处理得到质量分数5%发酵原料后，分别接入体积分数1%、2%、3%、4%、5%纳豆菌液，在40℃恒温条件下发酵72 h后，按1.2.3操作，得蛋白水解液，测定水解度。

1.4.4 发酵温度对玉米蛋白粉水解度的影响

按1.2.2操作预处理得到质量分数5%发酵原料后，接入体积分数3%纳豆菌液，分别在32、36、40、44、48℃恒温条件下发酵72 h后，按1.2.3操作，得蛋白水解液，测定水解度。

1.4.5 正交试验设计

在单因素试验结果基础上，以水解度为指标，设计L9（34）正交试验，对玉米蛋白粉水解条件进行优化，采用SPSS软件对正交试验数据进行极差和方差分析，因素水平见表1。

2 结果与分析

2.1 玉米蛋白粉质量分数对玉米蛋白粉的水解度影响在接种量体积分数、发酵温度、发酵时间相同的条件下，考查不同玉米蛋白粉质量分数对玉米蛋白粉水解度的影响，结果见图1。

图1 玉米蛋白粉质量分数对玉米蛋白粉水解度的影响Fig.1 Influence of mass fraction of corn protein powder on DH

由图1可知，玉米蛋白粉质量分数5%时，发酵后玉米蛋白粉水解度最大。玉米蛋白粉质量分数低于5%时，随着蒸馏水体积增多，水解度变小。原因可能是蒸馏水体积的增多，导致玉米蛋白粉浓度降低，纳豆菌产生的酶浓度降低，未能充分水解玉米蛋白粉。玉米蛋白粉质量分数高于5%时，水解度呈下降趋势，原因可能是玉米蛋白粉未能充分浸泡蒸煮，而影响其发酵水解度。故玉米蛋白粉质量分数5%时，对玉米蛋白粉做预处理为较佳条件。

2.2 发酵时间对玉米蛋白粉的水解度影响

在玉米蛋白粉质量分数、发酵温度、接种量体积分数相同条件下，考查不同发酵时间对玉米蛋白粉水解度的影响，结果见图2。

图2 发酵时间对玉米蛋白粉水解度的影响Fig.2 Influence of fermentation time on DH of corn protein powder

由图2可知，发酵时间在72 h时，玉米蛋白粉的水解度达到最高，在72 h之前，呈上升趋势，其原因可能是随着发酵时间的增加，菌体产生水解玉米蛋白粉的蛋白酶增多。超过72 h之后，玉米蛋白粉水解度略有下降趋势，其原因可能是发酵液中的营养成分缺乏，使菌种的生长和产酶能力受到了限制。因此，发酵时间选取72 h较佳。

2.3 接种量体积分数对玉米蛋白粉的水解度影响

在玉米蛋白粉质量分数、发酵温度、发酵时间相同条件下，考查不同的接种量体积分数对玉米蛋白水解度的影响，结果见图3。

图3 接种量体积分数对玉米蛋白粉水解度的影响Fig.3 Influence of volume fraction of inoculums size on DH of corn protein powder

由图3可知，发酵原料中接入体积分数3%纳豆菌对其发酵时，其水解度最大。当接种量体积分数少于3%时，其水解度呈上升趋势，其原因是纳豆菌少时产生的酶较少，发酵原料不能充分作用，随着接种量体积分数增加，产生的蛋白酶随之增加，水解度变大。当接种量体积分数多于3%时，其水解度呈下降趋势。随着纳豆菌增加，所需的营养成分缺乏，使菌种的生长和产酶能力受到了限制。因此，选取接种量体积分数为3%较佳。

2.4 发酵温度对玉米蛋白粉的水解影响

在玉米蛋白粉质量分数、发酵时间、接种量体积分数相同条件下，考查不同发酵温度对玉米蛋白粉水解度的影响，结果见图4。

图4 发酵温度对玉米蛋白粉水解度的影响Fig.4 Influence of fermentation temperature on DH of corn protein powder

由图4可知，32℃～40℃时，随着发酵温度的升高，玉米蛋白粉的水解度变大，40℃时，其水解度最大，超过40℃后，其水解度变小，其原因是温度较低时，未达到纳豆菌生长繁殖和酶的最适温度。温度过高使纳豆菌产生的蛋白酶部分失活。故发酵温度选取40℃较佳。

2.5 玉米蛋白粉的发酵工艺正交试验结果

对玉米蛋白粉水解条件进行极差和方差分析，结果见表2和表3。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiments

表3 方差分析结果Table 3 Results of ANOVA

2.6 优势组合试验指标的点估计及其置信区间1）优势组合水解度的估计：

2）区间估计为

y优±εα（本试验显著因素的最大显著性水平α= 0.01）

式（3）中：fe′为不显著因素与不显著交互作用的自由度之和；Se′为不显著因素与不显著交互作用的偏差平方和之和；N为试验总次数；f*为显著因素与显著交互作用的自由度之和。

由于fe=18；fe′=0；fe*=8；Se=0.970；Se′=0；N= 9；F0.01（2，18）=6.01；

综上所述，对玉米蛋白粉水解条件优化组合分析：由R可知影响其水解条件的最优条件因素主次是D>B>C>A，对表直观分析可确定优化组合是A2B3C2D2。即接种量体积分数4%、玉米蛋白粉质量分数5%、发酵温度40℃、发酵时间72 h。正交试验中优势组合的水解度理论预测值为11.25%，水解度的置信区间在（11.25-0.57）%和（11.25+0.57）%之间，即在10.68%～11.82%之间，此时的置信度为99%。

2.7 验证试验

在最优发酵条件下对玉米蛋白粉水解，做三次重复实验。测得玉米蛋白粉水解度均值为11.17%，在置信区间10.68%～11.82%内，与理论预测值基本相符。

3 结论

通过对纳豆菌发酵玉米蛋白粉制备玉米肽的单因素试验和四因素三水平正交试验，分析了对接种量体积分数、玉米蛋白粉质量分数、发酵温度、发酵时间四因素对玉米蛋白粉制备玉米肽水解度的影响。得出最优水解条件：发酵温度为40℃，发酵时间为72 h，接种量体积分数为4%，玉米蛋白粉质量分数为5%。此水解条件在显著性水平α=0.01上做验证试验，得到玉米蛋白粉水解度为11.17%。与理论预测值基本相符。

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Optimization of Fermentation Process for Polypeptide from Corn Protein Powder via Bacillus Natto

XU Yan-yang，ZHU Zhi-hong，LI Qing，TANG Yang-yang，ZHANG Ling
（College of Biological and Agricultural Engineering，Jilin University，Changchun 130022，Jilin，China）

In order to explore preparation technique of corn peptides，fermentation process of corn peptides from corn protein powder via bacillus natto was studied.Based on single factor experiments of volume fraction of inoculums size，mass fraction of corn protein powder，fermentation temperature and fermentation time，fermentation conditions of corn peptides were optimized by orthogonal experiments design of four-factor and three-level.Optimal fermentation conditions were fermentation temperature of 40℃，fermentation time of 72 h，volume fraction of inoculums size of 4%and mass fraction of corn protein powder of 5%.Under this fermentation conditions，degree of hydrolysis of corn protein powder was at 11.17%，which was consistent with theoretical prediction value.

corn protein powder；corn peptides；Bacillus natto；degree of hydrolysis；orthogonal experiment

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.021

2013-04-23

吉林大学大学生创新训练计划项目（2012C45167）；吉林省科技发展计划项目（20120717）；吉林大学基本科研业务费项目（2013138；200903263）

徐艳阳（1972—），女（汉），副教授，博士，主要从事食品营养与安全研究。