响应面法优化艾蒿黄酮的微波提取工艺的研究

王婷婷，杨雯雯，李岩，傅航

（漯河职业技术学院食品工程系，河南漯河462000）

响应面法优化艾蒿黄酮的微波提取工艺的研究

王婷婷，杨雯雯，李岩，傅航

（漯河职业技术学院食品工程系，河南漯河462000）

采用微波辅助提取法对艾蒿黄酮的提取工艺进行研究。在单因素试验的基础上，采用BBD（Box-Behnken Design）响应面法优化艾蒿黄酮提取工艺条件，结果表明，艾蒿黄酮提取的最佳工艺条件为：微波功率240 W，酒精浓度为71%，料液比为1∶25.5（g∶mL），微波时间为2.5min，在此条件下提取2次，艾蒿黄酮含量为26.25mg/g。

响应面；微波；艾蒿；黄酮；提取

艾蒿是菊科蒿属多年生野生草本植物，作为我国传统的中药之一其主要有效成分有很多，包括挥发油、萜类、黄酮类、香豆素类、色原酮类等化合物[1]。沈铭高[2]利用气质联用仪分析了艾草的化学成分，得出了艾草茎有38种、叶有43种活性物质。黄酮是植物的一些次级代谢产物，是许多中草药的有效成分，许多研究表明，黄酮类化合物具有降脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、抗心率失常等作用[3]，所以其具有极广的开发应用前景。

目前提取黄酮类的方法很多，研究对象也很多，但微波辅助提取艾蒿中黄酮的报道。本试验以乙醇作为提取剂，采用微波法，通过单因素试验和响应面法对艾蒿黄酮的提取工艺进行了优化。为艾蒿的进一步开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

艾蒿：采自漯河。选取有光泽，茎叶完整艾蒿，蒸馏水洗净后晾干，60℃烘箱中烘干，然后磨成细粉，用石油醚70℃回流2次，3 h/次，除去脂及脂溶性色素，滤渣60℃烘干，备用。

试剂：无水乙醇、亚硝酸钠、芦丁、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。

1.2 仪器

7200型紫外—可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；DHG-9101-0型电热恒温鼓风干燥箱：上海三发科学仪器有限公司；WG700SL23-K6微波炉：美的股份有限公司；FA1004型电子天平：上海上平仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 总黄酮含量的测量[4]

以芦丁为标样，与亚硝酸钠—硝酸铝发生显色反应，通过吸光度的测定绘制标准曲线，为Y=0.420 1X+ 0.012 1，从而测定艾蒿中的黄酮含量。

1.3.2 样品的测定

取提取液0.1 mL，置于25 mL容量瓶中，加水至12.5 mL，加5%亚硝酸钠溶液0.7 mL摇匀，放置5 min后，精确加入10%硝酸铝溶液0.7 mL摇匀，放置5 min加人1 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，水稀释至刻度。以水为空白，于510 nm波长下测定吸光度Y，由标准曲线得对应浓度X，可算得艾蒿样品的总黄酮含量。

1.3.3 微波处理预试验[5]

取相同的三角瓶，分别加乙醇30 mL，用保鲜膜封口，分别在不同的功率下进行处理，观察发现样品在80 W下240 s沸腾，240 W下180 s沸腾，480 W下40 s沸腾。为便于试验控制，微波功率选择为240 W。以后的实验中微波辐射时间均应短于相应微波强度的沸腾时间，超出沸腾时间，提取液容易溅出，实验结果不准确。

1.3.4 单因素试验

以提取剂选择、乙醇浓度、提取次数、料液比、微波时间5个因素进行单因素试验。

1.3.5 响应面法实验设计[6-7]

根据单因素试验，优化最佳条件的范围，采用Box-Behnken设计实验方案，分别以影响最大的因素为自变量（A：料液比；B：微波时间；C：酒精浓度），艾蒿黄酮含量为响应值，每个变量分别以-1，0，1表示，设计响应面试验（见表1），进行三因素三水平共计17个试验点（5个中心点）的二次回归组合设计试验，确定提取的最佳工艺条件。

表1 响应面三因素三水平试验设计Table 1 Experimental design of 3 factors and 3 levels in response surface method

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的确定

黄酮的提取方法有很多种，主要有水提取法、有机溶剂回流法、超声波提取法等。有机溶剂易渗入至原料内部，提取效果好于水提取法；超声波提取法效果也很好，但设备不常用，实验时受到限制[8]。由于乙醇原料易得，食用安全性高，价格较低且回收容易，因此本实验选用乙醇作为艾蒿黄酮的提取溶剂。

2.2 乙醇浓度对黄酮含量的影响

称取0.5 g样品于三角瓶中。按料液比为1∶30（g∶mL），分别加入浓度为30%、60%、70%、80%的乙醇，微波240 W加热2 min，提取两次间隔时间为5 min（下同），取出，冷却，过滤，定容至30 mL。测定不同乙醇浓度下黄酮的含量，见图1。

图1 不同乙醇浓度对黄酮提取量的影响Fig.1 Effects of different the concentration of on the content of flavonoids

结果显示，乙醇浓度对黄酮含量影响较大，在乙醇浓度低于70%时，艾蒿叶黄酮的含量随乙醇浓度的增大而提高，这可能是随着浓度的增大，细胞内外渗透压增大，细胞失水，从而促进黄酮溶出，但当乙醇浓度高于70%时，艾蒿黄酮的含量却降低，这可能与黄酮种类有关[9]，本文后续实验选择乙醇浓度为70%。

2.3 提取次数对黄酮含量的影响

称取样品0.5 g于三角瓶中，在70%的乙醇，液料比为1∶30（g/mL），微波时间2 min，240 W条件下，提取次数分别为1、2、3、4次，测定并计算提取液中黄酮的含量，结果见图2。

图2 不同提取次数对黄酮提取量的影响Fig.2 Effects of different the extraction ethanol times on the content of flavonoids

实验结果显示，4次浸提对黄酮总量的分别为18.9、21.9、22.1、22.2 mg/g，说明前2次浸提已将绝大部分黄酮类物质提取出来，故选择提取次数为2次。

2.4 料液比对黄酮含量的影响

称取样品0.5 g于三角瓶中，选择在料液比为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），乙醇浓度70%，提取时间为2 min，功率为240 W的条件下提取2次，测定并计算提取液中黄酮的含量，见图3。

图3 不同料液比对黄酮提取量的影响Fig.3 Effects of different material-liquid ratio On the content of flavonoids

实验结果表明，含量随液料比的增大出现先升高后下降的趋势，先升高的原因可能是料液比增大促使体系传质推动力增大，从而有利于黄酮的溶出，到1∶30（g/mL）达到最大，以后黄酮的含量逐渐下降，这可能是因为体系总体积增大时，溶剂吸收了更多热量，从而使黄酮的溶出时间变长。综合考虑本实验采用料液比1∶30（g/mL）。

2.5 微波时间对艾蒿黄酮含量的影响

称取样品0.5 g于三角瓶中。按料液比1∶30，70%乙醇，提取2次。微波240 W加热1.5、2.0、2.5、3.0 min，测定不同微波时间下黄酮的含量，见图4。

图4 不同微波时间对黄酮提取量的影响Fig.4 Effects of different micro-wave time On the content of flavonoids

图4表明，随微波时间的延长，黄酮含量呈先增加而后降低的趋势，在微波时间2.5 min时含量最高。当微波时间超过2.5 min后，含量呈下降趋势。这可能是随着微波时间延长，溶液达到沸腾，导致乙醇挥发，从而影响了提取效果，故本实验选择微波时间选择2.5 min。

3 响应面分析法

在单因素试验的基础上，确定对影响艾蒿中总黄酮含量的主要因素为乙醇浓度、微波时间、料液比，对这3个因素进行box-behnken实验设计，从而得到优化的提取工艺参数。

3.1 响应面试验结果分析

以乙醇浓度、提取温度、提取时间为自变量，以艾蒿黄酮含量为响应值，进行响应面分析试验，试验结果见表2。

表2 实验设计及结果Table 2 Test design and results of Box-behnken method

通过对表2试验结果进行响应面分析，经过二次回归拟合后，得出拟合方程如下：

黄酮含量=25.994 00-1.951 25A-0.728 75B-0.197 50C-2.157 00A2-1.792 00B2-3.899 50C2-0.955 00AB-1.517 50AC-0.347 50BC，其中方差分析见表3。

模型的方差分析结果表明，因变量和全体自变量之间相关性极显著（R=155.14/158.29=0.980 0），说明模型能解释98%的响应值变化。模型的F值为38.25（P＜0.001），说明回归模型极显著。失拟项不显（P=0.101 6），表明模型选择合适，可用此模型对试验进行分析和预测。显著性检验表明，料液比对黄酮含量极显著（P＜0.001），微波时间对黄酮含量显著（P＜0.05），而酒精浓度对黄酮含量不显著，料液比和酒精浓度两因素间的交互作用影响极显著（P＜0.05），料液比和微波时间两因素间的交互作用影响显著（P＜0.01）；从单因素影响来看，料液比对黄酮含量的影响较大，其次是微波时间，影响最小的是酒精浓度。

表3 方差分析表Table 3 Analysis table of varianc

3.2 响应面分析对黄酮含量的影响

响应面分析对黄酮含量的影响，见图5～图7。

图5 料液比及微波时间对黄酮含量的响应面分析Fig.5 Response surface plot for yield as the material-liquid ratio and micro-wave time

图6 酒精浓度及料液比对黄酮含量的响应面分析Fig.6 Response surface plot for yield as the material-liquid ratio and concentration of ethanol

图5～图7是根据回归方程所得的各因素对黄酮含量影响的响应面，一般选取2个交互的因素，其他因素固定在零水平，来对其进行响应面分析，结果表明，当等高线趋于圆形时，两因素的交互作用弱，当等高线呈现椭圆形时，两因素作用最强。

图5表示酒精浓度为70%时，料液比和微波时间对黄酮含量影响。黄酮含量随着微波时间的增大呈现先增大后减小的趋势，在2.46 min时达到最大，以后减少的趋势减慢。随着料液比的增大黄酮含量也出现先增大后减少的趋势，在料液比为1∶25.67（g/mL）达到最大，后减少的趋势较为显著，这说明料液比的影响更加显著，两者交互作用显著。经分析，在酒精浓度为70%，料液比1∶25.67（g/mL），微波时间2.46 min时，黄酮含量达到最大值26.448 3 mg/g。

图6表示，微波时间为2.5 min时，料液比与酒精浓度对黄酮含量影响。黄酮含量随着料液比的增大而减少，减少趋势明显，表现为曲线较陡；随着酒精浓度的增大，黄酮含量也出现先增大后减少的趋势，酒精浓度为70.67%时达到最大，以后变化趋势较缓慢，表现为曲线平滑，这说明料液比要比酒精浓度的影响显著，经分析微波时间在2.5 min时，料液比为1∶25.23（g/mL），酒精浓度为70.67%时黄酮含量值达到最大26.451 7 mg/g。

图7表示料液比为1∶30（g/mL）时，微波时间与酒精浓度及其交互作用对黄酮含量影响。酒精浓度和微波时间的交互作用不明显，等高线接近圆形，黄酮含量随着酒精浓度和微波时间的增加都出现先增加后减少的趋势，在微波时间为2.4 min，酒精浓度为69.83%时，黄酮含量达到最大为26.069 1 mg/g。

图7 酒精浓度及微波时间对黄酮含量的响应面分析Fig.7 Response surfzce plot for yield as the ratio of micro-wave time and concentration of ethanol

4 结论

通过响应面优化，得到实验的最佳提取条件为，料液比为1∶25.43（g/mL），微波时间为2.48 min，酒精浓度为70.68%时，预测黄酮含量达到26.464 9 mg/g，为方便实验，将实验优化为料液比为1∶25.5（g/mL），微波时间为2.5min，酒精浓度为71%，做艾蒿黄酮提取验证试验。艾蒿黄酮的实际一次提取率可达26.25 mg/g。本试验中建立的数学模型能较好地预测各因素与提取率之间的关系。

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Optimization of the Microwave-assisted Extraction Technology of Flavonoids from Artemisia Argyi Using Response Surface Methodology

WANG Ting-ting，YANG Wen-wen，LI Yan，FU Hang
（Department of Food Engineering Luohe Vocational Technology College，Luohe 462000，Henan，China）

response surface；micro-wave；Artemisia Argyi；flavonoids；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.009

2013-05-14

王婷婷（1981—），女（汉），讲师，硕士，主要从事食品生物技术方面研究。

Abstract：Microwave-assisted extraction method was used to investigate the extraction of the flavonoidsfrom Artemisia argyi.The method of response surface analysis with BBD was adopted to optimize the extraction conditions of flavonoids on the basis of single-factor experiment．The results showed that optimal conditions for extraction of flavonoids could be reached that under micro-wave power of 240 W，ethanol concentration of 71%，ratio of material to solution of 1∶25.5（g∶mL），extracted 2 times and micro-wave time of 2.5 minutes．In such conditions，flavone content in Artemisia argyi was 26.25 mg/g.