甲壳素及其衍生物的制备与抑菌活性研究

尹秀莲，游庆红，3，周兴海

（1.淮阴工学院江苏省生物质转化与过程集成工程实验室，江苏淮安223001；2.南京大学淮安高新技术研究院，江苏淮安223001；3.江苏省生物质能与酶技术重点实验室，江苏淮安223300）

甲壳素及其衍生物的制备与抑菌活性研究

尹秀莲1，2，游庆红1，2，3，周兴海1

（1.淮阴工学院江苏省生物质转化与过程集成工程实验室，江苏淮安223001；2.南京大学淮安高新技术研究院，江苏淮安223001；3.江苏省生物质能与酶技术重点实验室，江苏淮安223300）

对从龙虾废弃物制备的甲壳素、壳聚糖及其衍生物甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐对3种G-菌与3种G+菌的抗菌活性进行了研究。MIC试验结果表明甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐对所有测试菌株的MIC均＜0.01%，比甲壳素、壳聚糖表现出更高的抑菌活性。通过绘制生长曲线，对4种物质的抑菌活性进行研究，结果表明0.1%的壳聚糖能抑制64%的枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，说明杆菌属对壳聚糖比较敏感，甲壳低聚糖对G+菌都表现出较强的抑菌作用，氨基葡萄糖盐酸盐能完全抑制金黄色葡萄球菌的生长。甲壳素和壳聚糖对G-大肠杆菌、绿脓假单胞菌有一定的抑制作用，对沙门氏菌基本没有抑制作用。0.1%的甲壳低聚糖与氨基葡萄糖盐酸盐对几种G-菌的抑制作用较强。甲壳素和壳聚糖可作为较有效的抑菌剂，甲壳低聚糖与氨基葡萄糖盐酸盐可作为几种受试G-菌的杀菌剂。

甲壳素；壳聚糖；甲壳低聚糖；氨基葡萄糖盐酸盐；抑菌

甲壳素以高度有序的结晶微纤维形式广泛存在于虾壳、蟹壳、昆虫外壳、真菌和藻类等细胞壁中，是地球上除蛋白质外含氮量最高的天然有机化合物[1]，壳聚糖是甲壳素经脱乙酰基后的产物，是一种天然高分子的多糖化合物，壳聚糖是目前研究得比较多的一种天然防腐保鲜剂，甲壳素和壳聚糖由于其分子结构中内外氢键的相互作用，形成了有序的大分子结构，相对分子质量通常在几十万至几百万，不溶于水等一般溶剂，应用受到极大限制。经过降解得到的低相对分子质量壳聚糖不仅溶解性好，而且具有某些独特的性质[2-3]。D-氨基葡萄糖盐酸盐又称葡萄糖胺盐酸盐，葡萄糖结构中C2-羟基被氨基取代，盐酸与氨基成盐，是甲壳素的一种重要衍生物[4]。

近年来，甲壳素、壳聚糖及其衍生物对不同的微生物例如细菌、酵母菌及真菌等的抑制作用引起学者们广泛的重视，并对其抑菌机制进行了研究[5-6]。关于壳聚糖在食品防腐保鲜方面的应用的研究越来越多，但是在壳聚糖的抑菌机理和抑菌特性方面，不同的研究者得出的结论去不尽相同[7]。目前，虽然对甲壳素、壳聚糖及其衍生物的抑菌活性研究较多，但是大多都是对其中的单个成分的抑菌活性研究，系统研究较少。本实验以龙虾废弃物为原料，制备甲壳素、壳聚糖及甲壳低聚糖，并对其抑菌活性进行系统研究比较，为甲壳素、壳聚糖及其衍生物在食品、饲料等工业领域的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株

三株G+：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）， 枯 草 芽 孢 杆 菌 （Bacillus subtilis，ATCC6633）， 蜡 样 芽 孢 杆 菌 （Bacillus cereus，ATCC11778）；三株G-：大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC25922），绿脓假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）， 沙 门 氏 菌 （Salmonella typhi，ATCC14028），购于ATCC菌种保藏中心。

1.1.2 主要材料与试剂

龙虾壳：取自江苏盱眙地产龙虾；其余所用试剂均为国产分析纯。

1.1.3 实验仪器

QYC－211恒温摇床：上海福马实验设备有限公司；BCM－1000超净工作台：苏州净化设备有限公司；HH－6数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；UV－2401PC紫外分光光度计：日本岛津。

1.2 方法

1.2.1 甲壳素及壳聚糖的制备

采用参考文献[8]的方法，以龙虾壳为原料，酸碱法处理后，得到甲壳素。甲壳素在NaOH溶液中回流脱乙酰基，得壳聚糖。

1.2.2 甲壳低聚糖的制备[9]

取壳聚糖按比1∶30（W/V）比例加入到2%乙酸溶液中，振摇，使其完全溶解呈均相状态。在80℃条件下滴加浓度为3%的H2O2溶解的壳聚糖中1 h，边滴边搅拌，滴加完毕继续反应2 h，H2O2量与壳聚糖乙酸溶液量比例为1∶5。用2 mol/l NaOH溶液将反应液pH调到10，滤液加3倍量乙醇（体积分数），放置过夜，抽滤，经30℃真空干燥得甲壳低聚糖。

1.2.3 氨基葡萄糖盐酸盐的制备[10]

称取0.3 g壳聚糖，溶于100 mL 1%（体积分数）的醋酸溶液中，用搅拌使其充分溶解，按壳聚糖与盐酸溶液1∶7的比例加入15%盐酸水解3 h，过滤，得氨基葡萄糖盐酸盐粗品溶液。

取氨基葡萄糖盐酸盐溶液加入质量分数为95%的乙醇调节乙醇终浓度至75%，摇匀后静止放置12 h后析出沉淀，过滤，得淡黄色氨基葡萄糖盐酸盐粗品。粗品用蒸馏水溶解，过滤，加丙酮重结晶3次。

将上述得到的结晶状物用蒸馏水溶解，按质量浓度0.1%的比例加入活性炭，搅拌，然后抽滤，得到透明澄清的滤液，滤液浓缩后加入丙酮，沉淀过滤、干燥，得到白色晶体状氨基葡萄糖盐酸盐。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）及抑菌活性的测定[11]

定量称取无菌甲壳素、壳聚糖、甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐，溶于1%的醋酸溶液使成1%（w/v）的溶液，然后加入到MH琼脂菌悬液中，使其最终浓度分别为0.1%、0.08%、0.05%、0.01%、0.005%、0.003%（w/v），然后于摇床37℃培养一定时间。于640 nm测定菌悬液浊度来确定抑菌效果，MIC定义为完全抑制细菌生长的最低浓度。阴性对照组为取1%的醋酸溶液加入到MH琼脂菌悬液中，然后于摇床37℃培养。

以吸光度值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制不同样品的时间-吸光度曲线（生长曲线）。

1.2.5 壳聚糖脱乙酰度的测定

采用文献[12]的方法，以甲基橙-苯胺蓝为指示剂，用NaOH标准溶液滴定，根据NaOH的量即可算出样品的脱乙酰度（DD）。

1.2.6 甲壳素与壳聚糖的黏均分子量的测定

采用黏度法[7]。甲壳素的溶剂采用二甲乙酰胺，壳聚糖的溶剂为用0.2 mol/L乙酸-0.3 mol/L乙酸钠溶液，在30℃的恒温水槽中进行。相对分子质量的计算用Mark-Houwink经验公式：

式中：[η]为黏度，甲壳素常数K为1.81×10-3mL/g，α为0.93。

1.2.7 甲壳低聚糖分子量测定

以氨基葡萄糖为标准品，以DNS试剂为反应试剂，于520 nm处测定吸光度值，按文献[13]方法计算甲壳低聚糖分子量。

2 结果与分析

2.1 所得样品性质

试验中所得的甲壳素的经测定黏均分子量为41× 104U，脱乙酰度为32%。壳聚糖的黏均分子量5×104U，脱乙酰度为75%。甲壳低聚糖均分子量为2 100 U。

2.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定

甲壳素、壳聚糖、甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐的最低抑菌浓度见表1。

表1 最低抑菌浓度（MIC）Table 1 Minimum inhibitory concentration（MIC）%

甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐对测试菌种的MIC比甲壳素、壳聚糖要低。甲壳素、壳聚糖对不同的菌株的MIC有着较大的差异，对绿脓假单胞菌、沙门氏菌的MIC大于等于0.1%，甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐对所有测试菌株的MIC均较小，说明甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐对所测试菌株比甲壳素、壳聚糖表现出更高的抑菌活性。

4种抑菌物对G-菌的MIC值统计分析表明，甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐的抑菌性能与甲壳素、壳聚糖的抑菌性能具有极显著差异（p＜0.01），对G+中的金黄色葡萄球菌具有极显著差异（p＜0.01），但是对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌，4种抑菌物都表现出了一定的抑菌性能，彼此不存在显著性差异。

2.3 各样品的抑菌效果

2.3.1 对G+的抑制效果

0.1%（w/v）的甲壳素、壳聚糖、甲壳低聚糖及氨基葡萄糖盐酸盐对几种G+菌的抑菌特性见图1、图2、图3。

图1 金黄色葡萄球菌Fig.1 Staphylococcus aureus

图2 蜡样芽孢杆菌Fig.2 Bacillus cereus.Frankland

图3 枯草芽孢杆菌Fig.3 Bacillus subtilis

横坐标为菌种培养时间，纵坐标为640 nm处吸光度，吸光度值越小表明抑菌效果越好。

从图1中可以看出，阴性对照组中金黄色葡萄球菌生长很迅速，在培养5 h后达到稳定期，其吸光度为0.54。加入样品的实验菌株生长缓慢，含有0.1%的甲壳素和0.1%的壳聚糖的两组实验在8 h达到稳定生长期，吸光度值分别为0.40、0.37，说明甲壳素与壳聚糖对金黄色葡萄球菌的生长有一定的抑制作用。甲壳低聚糖及氨基葡萄糖盐酸盐表现出相对较强的抑制活性，甲壳低聚糖组在3 h达到最大吸光度值，且吸光度值仅为0.18，氨基葡萄糖盐酸盐组先有一定的生长，到2 h时，吸光度值降低，然后趋于0，说明该组的实验菌株的生长完全被抑制。

由图2、图3可以看出，0.1%的壳聚糖能抑制64%的枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，说明杆菌属对壳聚糖比较敏感，与文献[13]报道的一致。甲壳素、甲壳低聚糖及氨基葡萄糖盐酸盐对杆菌属也有一定的抑制作用。

2.3.2 对G-的抑制效果

0.1%（w/v）的甲壳素、壳聚糖、甲壳低聚糖及氨基葡萄糖盐酸盐的对几种G-菌的抑菌特性见图4、图5、图6。

图4 大肠杆菌Fig.4 Escherichia coli

图5 沙门氏菌Fig.5 Salmonella

图6 绿脓假单胞菌Fig.6 Pesudomonas pyocyaneum

阴性对照组的细菌数量随着时间的增加而迅速增加，培养4 h后就达到了稳定期。甲壳素与壳聚糖对大肠杆菌有一定的抑制作用，约在4 h后达到稳定期，最大吸光度值为0.3、0.24，甲壳素和壳聚糖对大肠杆菌的抑制25%，对绿脓假单胞菌的抑制作用较弱，由图5可以看出，甲壳素组、壳聚糖组与对照组的曲线基本重合，说明甲壳素、壳聚糖对沙门氏菌基本没有抑制作用。0.1%的甲壳低聚糖与氨基葡萄糖盐酸盐对几种G-菌的抑制作用较强，4 h后吸光度值迅速降近0，甲壳低聚糖与氨基葡萄糖盐酸盐的抑菌活性比甲壳素和壳聚糖高，氨基葡萄糖盐酸盐为较有效的抑菌剂。

由结果可以看出，甲壳素与壳聚糖对大部分试验菌都有一定的抑制作用，但是，不能完全抑制试验菌的生长，存活的细菌会继续繁殖。壳聚糖的抗菌活性强于甲壳素，尤其是对G-菌，可能是由于壳聚糖有许多阳离子胺基可以与细菌细胞表面的多糖、脂类及蛋白质的阴离子基团结合从而抑制微生物的生长。其抑菌机理可能为其会导致菌体絮凝然后使其因为缺少营养及氧气从而使细菌死亡。然而，在本实验浓度下，壳聚糖与甲壳素不能把所有的细菌都杀灭，另外，如果壳聚糖的分子量小，其聚合键可以与多个细胞结合。由此，细菌细胞与壳聚糖聚合物链桥可以很容易的建立，从而使细菌迅速灭活。甲壳低聚糖与氨基葡萄糖盐酸盐可作为杀菌剂[13]。低聚糖可能能透过细菌的细胞壁，壳聚糖对细菌的抑制作用跟剂量有关。

3 结论

1）甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐对所有测试菌株的MIC均较小，说明甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐酸盐对所测试菌株比甲壳素、壳聚糖表现出更高的抑菌活性。

2）甲壳素、壳聚糖对G+菌都表现出一定的抑菌性能，0.1%的壳聚糖能抑制64%的枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌，说明杆菌属对壳聚糖比较敏感，甲壳低聚糖对G+菌都表现出较强的抑菌作用，氨基葡萄糖盐酸盐能完全抑制金黄色葡萄球菌的生长。

3）甲壳素和壳聚糖对大肠杆菌、绿脓假单胞菌有一定的抑制作用，对沙门氏菌基本没有抑制作用。0.1%的甲壳低聚糖与氨基葡萄糖盐酸盐对几种G-菌的抑制作用较强，氨基葡萄糖盐酸盐为较有效的抑菌剂。

4）甲壳素和壳聚糖可作为较有效的抑菌剂，甲壳低聚糖与氨基葡萄糖盐酸盐可作为几种受试G-菌的杀菌剂。

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Preparation and Antibacterial Activity of Chitin and Its Derivatives

YIN Xiu-lian1，2，YOU Qing-hong1，2，3，ZHOU Xing-hai1
（1.Jiangsu Provincial Engineering Laboratory for Biomass Conversion and Process Integration；Huaiyin Institute of Technology，Huaian 223001，Jiangsu，China；2.Huaian High-Tech Research Institute of Nanjing University，Huaian 223001，Jiangsu，China；3.Jiangsu Key Laboratory for Biomass-based Energy and Enzyme Technology，Huaian 223300，Jiangsu，China）

The antimicrobial activities of chitin，chitosan isolated from shrimp shell waste and their derivate chito-oligosaccharides，glucosamine hydrochlorid against three Gram-positive and three Gram-negative bacteria were studied.Results of MIC experiments showed that the MIC of chito-oligosaccharides and glucosamine hydrochlorid were all＜0.01%，their antimicrobial activities were higher than that of chitin and chitosan.Through growth curve，the antimicrobial activities were studied.Results showed that chitosan of 0.1%could inhibit 64% Bacillus subtilis and Bacillus cereus，which demonstrated that Bacillus are more sensitive to chitosan.Chitooligosaccharides showed strong antimicrobial activities to all Gram-positive bacteria.Gucosamine hydrochlorid could inhibit the growth of Staphylococcus aureus completely.Chitin and chitosan showed some inhibit activity on Gram-negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa，but have no effect on Salmonella typhi. chito-oligosaccharides and glucosamine hydrochlorid of 0.1%had strong inhibit effect on all three Gramnegative bacteria.Chitin and chitosan can be used as effective bacterial inhibitor，chito-oligosaccharides and glucosamine hydrochlorid can be used as bacteriocide of the three Gram-negative bacteria used in the experiments.

chitin；chitosan；chito-oligosaccharides；glucosamine hydrochlorid；antimicrobial activities

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.004

2013-05-30

江苏省科技厅资助项目（No.BN2011008）；江苏省教育厅资助项目（No.12KJB480003）；江苏省生物质能与酶技术重点实验室开放课题（No.JSBEET1203）

尹秀莲（1978—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：天然活性成分分离及应用。