基于气质联用技术的唾液乳杆菌渗胁迫响应代谢组学研究

龚霄，齐宁利，林丽静，陈晶瑜，韩北忠，*

（1.中国热带农业科学院农产品加工研究所，广东湛江524001；

2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

基于气质联用技术的唾液乳杆菌渗胁迫响应代谢组学研究

龚霄1，2，齐宁利1，林丽静1，陈晶瑜2，韩北忠2，*

（1.中国热带农业科学院农产品加工研究所，广东湛江524001；

2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

采用气质联用技术分析了高渗胁迫下唾液乳杆菌胞内代谢物变化，结果表明：不同细胞代谢模式下，氨基酸类、有机酸类、脂肪酸类、胺类和糖类及其衍生物等具有显著差异，这些代谢物直接参与了细胞渗透胁迫响应相关的主要生化反应和关键代谢通路。

唾液乳杆菌；渗透胁迫响应；气质联用；代谢组学

乳酸菌是指一类不产孢子、可发酵碳水化合物并产生大量乳酸的厌氧或兼性厌氧革兰氏阳性球菌或杆菌的统称[1]。乳酸菌具有调节人体肠道微生态平衡、提高免疫力、抗肿瘤、降胆固醇和延缓衰老等诸多生理功效，是同人类生活密切相关的重要益生菌之一，已被成功应用于乳制品、肉制品、果蔬和谷物等发酵产品的生产。

在工业化生产和应用过程中，乳酸菌面临酸或碱、氧气、温度、渗透压、饥饿等多种因素的胁迫，往往引起细胞活性衰减，甚至凋亡。高渗压是一种重要的食品贮藏手段，通过降低水分活度、减少溶解氧，从而抑制或消除微生物引起的腐败或污染。作为一种典型的胁迫环境，高浓度盐/糖加速活性氧簇的生成，抑制或阻断细胞中正常代谢活动，从而制约乳酸菌生产性能及益生功效的发挥[2]。经过长期的协同进化，微生物逐渐形成了应激防御系统。研究较多的是大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草杆菌、单增李斯特、植物乳杆菌和乳酸乳球菌，但主要集中在基因和蛋白水平[3-9]。采用气质联用技术研究唾液乳杆菌高渗胁迫下代谢物组的变化规律，有利于从代谢水平上全面揭示乳酸菌渗透调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

唾液乳杆菌FDB 86由中国农业大学功能乳品教育部北京市共建重点实验室提供。

1.2 主要试剂与仪器设备

液体培养基：牛肉膏10 g，胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，柠檬酸三铵2 g，K2HPO42 g，MgSO40.5 g，MnSO40.25 g，NaAc 5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水1 L，pH 6.8，121℃灭菌20 min备用。在液体培养基中添加适量NaCl（0.8 M），即为高渗培养基。N-甲基-N-（三甲硅基）三氟乙酰胺（MSTFA，≥98.5%，色谱纯），甲氧胺盐酸盐（OMHA，≥98.5%，分析纯），核糖醇（99%，标准品），无水吡啶（≥99%，色谱纯）购自美国Sigma Aldrich公司；色谱级甲醇、氯仿购自美国Fisher公司；其它化学试剂均为国产分析纯。

6890-5973 N气质联用仪：美国Agilent公司；LGJ-18低温真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技公司；UF/UVPL5124超纯水制备仪：美国Pall公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

稳定期唾液乳杆菌细胞培养液通过0.45 μm滤膜抽滤，生理盐水冲洗2次～3次，迅速收集菌体并用液氮淬灭。采用甲醇/氯仿/水（1∶1∶1）溶剂体系提取，8 944×g离心5 min收集水相，加入核糖醇母液至终浓度为0.05 mmol/L，然后进行低温真空冷冻干燥。

1.3.2 GC/MS分析

参照于海龙的方法将提取物衍生化[10]。测试条件如下：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Folsom，CA）；不分流进样，进样量2 μL；载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min。升温程序：初始炉温60℃，保持1 min，以20℃/min线性升温至230℃，保持1 min，再以15℃/min升温至280℃并保持10 min；接口温度250℃，离子源温度230℃。质谱条件：溶剂延时4.2 min；电离方式：EI；电子能量70 eV，扫描范围：m/z 40～600。

2 结果与分析

2.1 唾液乳杆菌胞内代谢物模式识别

对不同条件下的稳定期唾液乳杆菌胞内代谢物组进行主成分分析，结果发现：不同条件下的代谢物样本分布于PCA模型不同象限，在PC1和PC2维度上都达到了较好的区分效果，累计贡献率达到85.01%。

2.2 唾液乳杆菌渗透调节相关的代谢差异分析

通过GC/MS检索发现40多种代谢物，包括氨基酸类、有机酸类、脂肪酸类、胺类和糖类等，见表1。磷酸类物质参与细胞中多种生物大分子结构组成，作为中间代谢物与能量代谢直接偶联。如磷酸葡萄糖酸的积累和磷酸戊糖途径直接相关，它为生物体中还原性生化合成反应提供NADPH（磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，即辅酶Ⅱ），并为核酸合成提供戊糖。糖代谢加强导致由糖氧化及磷酸戊糖循环提供的乙酰CoA及NADPH增多，有利于磷脂酰脂肪酸积累，进一步促进脂肪酸合成。十六烷酸和十八烷酸参与了细胞中的脂类代谢，并且和胆碱、肉毒碱的代谢呈相关；十八碳三烯酸参与细胞膜和生物酶构成，有利于提高逆境下细胞膜流动性。N-乙酰葡糖胺是许多杂多糖的组成成分，去酰基后生成葡萄糖胺，有利于细胞结构维持；甘油硬脂酸酯具有较强乳化能力，可有效降低水的表面张力，有利于渗透胁迫下细胞内水分的保持；麦角固醇是真菌细胞膜的重要组成成分，它在确保膜结构的完整性、与膜结合酶的活性、膜的流动性、细胞活力等方面起着重要作用。高渗胁迫下，甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和异亮氨酸含量明显上调，而谷氨酰胺的积累显著下降；鸟氨酸不属于必需氨基酸，但存在于短杆菌酪肽、短杆菌肽S等的抗菌性肽中，作为尿素循环的一部分与尿素生成相关[11]。在生物体内与精氨酸、谷氨酸、脯氨酸能相互转变，可与α-酮酸、乙醛酸进行氨基转移，进一步合成多胺，高渗胁迫显然促进了这一途径的反应，使鸟氨酸得以利用；此外，唾液酸的合成受到抑制，其相关益生功效也必然会受到影响[12]。

表1 唾液乳杆菌胞内代谢物PCA模型之间的差异代谢物Table 1 Metabolites derived from L.salivarius PCA models

3 结论

采用气质联用技术对不同培养条件下唾液乳杆菌胞内代谢物组进行了分析，找到多组差异代谢物，这些物质直接或间接参与细胞渗透调节，是抵抗渗透胁迫的潜在生物标志物。通过主成分分析发现，不同处理下的代谢样本得到了较好区分，表明基于气质联用技术的代谢组学研究在一定程度上有助于区分唾液乳酸菌不同培养条件下的代谢模式。由于样品分析中也存在定性定量的困难，将不同代谢组学技术进行整合，对探究微生物胁迫响应机制具有重要意义。

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GC/MS Based Metabonomics Study on Osmotic Response of Lactobacillus salivarius

GONG Xiao1，2，QI Ning-li1，LIN Li-jing1，CHEN Jing-yu2，HAN Bei-zhong2，*
（1.Agriculture Product Processing Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences，Zhanjiang 524001，Guangdong，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

In this work，intracellular metabolite profiles of Lactobacillus salivarius on hypertonic stress were analyzed using GC/MS method，and the result showed amino acids，organic acids，fatty acids，amines，and sugars and their derivatives were significantly different between different metabolic models，which were directly involved in the cell response to osmotic stress-related biochemical reactions and key metabolic pathways.

Lactobacillus salivarius；osmotic response；GC/MS；metabonomics

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.003

2014-04-24

中国热带农业科学院院本级基本科研业务费专项资金（1630062014019）；十一五国家科技支撑计划课题支持（2006BAD04A06）

龚霄（1984—），男（汉），副研究员，博士，主要研究方向：食品生物技术。

*通信作者