琥珀酰化改性对米糠蛋白功能性质的影响

翟爱华，马国飞，2，李丹

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319；2.中共友谊县委组织部，黑龙江双鸭山155800）

琥珀酰化改性对米糠蛋白功能性质的影响

翟爱华1，马国飞1，2，李丹1

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319；2.中共友谊县委组织部，黑龙江双鸭山155800）

为了改变米糠蛋白的功能性质，扩大米糠蛋白在食品工业的应用范围，利用琥珀酸酐对米糠蛋白进行酰化改性处理。通过单因素反应，确定了琥珀酸酐酰化改性米糠蛋白的最适反应条件为：米糠蛋白浓度为10%，反应温度为35℃，琥珀酸酐/蛋白质用量为15%。在最适反应条件下，分别反应40min、80min，制得酰化度分别为46.8%、69.2%的琥珀酰化米糠蛋白。评价了上述两种琥珀酰化米糠蛋白制品的溶解性、乳化性、起泡性等功能性质，结果表明，琥珀酰化改性对米糠蛋白的溶解性、乳化稳定性以及起泡性均有一定改善，而酰化米糠蛋白的乳化活性、泡沫稳定性随着酰化程度的提高有所下降。

琥珀酰化；米糠蛋白；功能性质

米糠约占稻谷重量的5%～5.5%，是稻谷碾米过程中产生的重要副产品。米糠中含有丰富的营养物质，其中脱脂米糠中含有高达18%的蛋白质。然而，目前大部分米糠仍被用作动物饲料，造成严重的资源浪费，因此，从米糠中提取蛋白质，增加米糠的附加值具有重要的现实意义。米糠蛋白被公认为优质植物蛋白质，其必需氨基酸组成均衡合理，接近FAO/WHO推荐模式；其中米糠蛋白含有较高的赖氨酸，是其他植物蛋白无法比拟的，米糠蛋白的生物效价很高，消化率可达90%以上；并且米糠蛋白属于低过敏性蛋白，是唯一一种可以免于过敏试验的谷物蛋白。因此，米糠蛋白非常适合作为婴幼儿和特殊人群营养食品。

虽然，米糠蛋白的营养特性已被广泛认可，但目前，米糠浓缩蛋白和分离蛋白并没有商品化，主要原因就是米糠蛋白的溶解性差，因为：①米糠蛋白是一种混合蛋白，其中含有：质量分数为37%的清蛋白、质量分数为36%的球蛋白、质量分数为22%的谷蛋白和质量分数5%的醇溶谷蛋白，超过三分之一的蛋白不能在水、盐、乙醇、乙酸中溶解（其对米糠蛋白的抽提率分别为34%，15%，6%，11%）；②米糠蛋白聚合度很高，分子间通过二硫键交联使蛋白溶解性变差；③米糠中植酸和纤维含量高（其质量分数分别为1.7%和12%），它们与蛋白质结合，使蛋白不易与其它成分分离[1-2]。

如何提高米糠蛋白的溶出得率成为国内外的研究热点。管骁等[3]研究了米糠蛋白制备过程中存在的提取率低、产品颜色深等问题。张敏等[4]按照Osbron法提取米糠中的清蛋白、球蛋白、醇蛋白、谷蛋白，并对4种蛋白进行功能性质评价。郑耀华等[5]以新鲜米糠为原料，采用碱法、酸法、盐法分步对米糠蛋白进行复合提取，并确定了复合法提取新鲜米糠蛋白的最佳方法。酰化改性属于简便易行的改性方法，在其他蛋白质改性中应用较广。张红印等[6]采用乙酸酐及琥珀酸酐对小麦面筋蛋白进行酰化改性，比较了酰化改性对小麦面筋蛋白功能性的改善效果。本研究选用琥珀酸酐作为酰化试剂对米糠蛋白进行酰化改性，通过对酰化米糠蛋白的功能性质的测定，以期获得具有良好功能性质的米糠蛋白制品，以便扩大米糠蛋白在食品加工业的应用范围，为食品生产提供良好的加工基料。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 原料

米糠蛋白：北大荒希杰食品科技公司；琥珀酸酐：天津市大茂化学试剂厂；牛血清白蛋白：北京索莱宝公司；茚三酮：天津市大茂化学试剂厂；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要设备

T6新世纪紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；AR2140电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；PH-3C pH计：上海安亭雷磁有限公司；DK-S24电热恒温水浴锅：上海森信试验仪器有限公司；TDS-050冷冻干燥试验机：抚顺黎明机械厂；FKA型组织捣碎机：江苏金坛市金城国胜实验仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 米糠蛋白琥珀酰化条件优化

1.2.1.1 底物质量分数对酰化程度的影响

将米糠蛋白分别配制成3%、6%、8%、10%、15% 5个浓度梯度的悬浮液，并用0.2 mol/L的NaOH溶液将蛋白溶液pH调至8.0～8.5。称取一定量的琥珀酸酐，向蛋白溶液中逐渐加入琥珀酸酐，加入量为米糠蛋白的10%，反应温度固定为25℃，进行琥珀酰化反应，反应时间为1 h。反应过程中，用磁力搅拌器进行搅拌，使米糠蛋白与琥珀酸酐充分反应，并加入一定量的NaOH溶液，保证反应过程中反应体系的pH在8.0～8.5之间。按照1.2.2采用茚三酮法测定酰化程度。

1.2.1.2 反应温度对酰化程度的影响

准确配制浓度为5%的米糠蛋白悬浮液，并用0.2 mol/L的NaOH溶液将蛋白溶液pH调至8.0～8.5。称取一定量的琥珀酸酐，向蛋白溶液中逐渐加入琥珀酸酐，加入量为米糠蛋白的10%。分别在25、30、35、40℃4个温度梯度下反应1 h。反应过程中，用磁力搅拌器进行搅拌，使米糠蛋白与琥珀酸酐充分反应，并加入一定量的NaOH溶液，保证反应过程中反应体系的pH在8.0～8.5之间。按照1.2.2采用茚三酮法测定酰化程度。

1.2.1.3 琥珀酸酐的用量对酰化程度的影响

准确配制浓度为5%的米糠蛋白悬浮液，并用0.2 mol/L的NaOH溶液将蛋白溶液pH调至8.0～8.5。称取一定量的琥珀酸酐。在25℃下，向反应体系逐渐加入琥珀酸酐，加入量分别为3%、5%、10%、15%、20% 5个用量梯度进行琥珀酰化反应1 h。反应过程中，用磁力搅拌器进行搅拌，使米糠蛋白与琥珀酸酐充分反应，并适当加入一定量的NaOH溶液，保证反应过程中反应体系的pH在8.0～8.5之间。按照1.2.2采用茚三酮法测定酰化程度。

1.2.2 相关分析

1.2.2.1 蛋白质酰化度的测定—茚三酮法[7-8]

米糠蛋白溶液经酰化反应后，于3 000 r/min离心15 min，取上清液2.0 mL稀释至25 mL，再取2 mL～2.5 mL米糠蛋白溶液于25 mL比色管，补加蒸馏水至4 mL，另加pH 8.0的磷酸盐缓冲液及茚三酮溶液各1 mL，混合均匀后水浴加热15 min，处理后迅速冷却至室温并加水定容至25 mL，静置15 min后，以蒸馏水为空白，测定其在570 nm处的吸光值。吸光度表示游离氨基酸与茚三酮试剂的反应程度，吸光度越大表示米糠蛋白的酰化程度越低。

酰化程度的公式为：

酰化程度（%）=（米糠蛋白的吸光值-酰化米糠蛋白的吸光值）/米糠蛋白的吸光值×100%

1.2.2.2 溶解性

配制浓度为1%的米糠蛋白（酰化米糠蛋白）溶液，平衡30 min，3 000 r/min离心30 min，取1 mL上清液于试管中，加入4 mL双缩脲试剂，剧烈震荡10 min后，放置30 min，于540 nm处进行比色。配置10 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA），分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，用蒸馏水补足到1 mL，加4 mL双缩脲试剂剧烈震荡10 min后放置30 min，于540 nm处进行比色，以吸光度值为横坐标，BSA浓度为纵坐标，绘制标准曲线。待测蛋白吸光度值代入标准曲线，可求出待测蛋白的浓度。以pH为横坐标，NSI（%）为纵坐标绘图，分析不同pH对米糠蛋白以及乙酰化米糠蛋白（琥珀酰化米糠蛋白）溶解性的影响。

双缩脲试剂的配置[7]：将3 g酒石酸钠和0.75 g硫酸铜溶于250mL蒸馏水。搅拌下徐徐加入150mL10% NaOH，最后定容至500 mL。

1.2.2.3 乳化性质

配制浓度为0.01%、0.02%、0.03%和0.04%的酰化米糠蛋白溶液。取150 mL蛋白溶液与50 mL大豆油混合，12 000 r/min均质1 min，静置，在0 min和10 min时从容器底部取50 μL乳状液于试管中，加5 mL 0.1%的SDS，充分混匀，于500 nm处测定吸光度值（以0.1%的SDS调整仪器零点）。同样处理、测定琥珀酰化米糠蛋白溶液。乳化活性指数（EAI）及乳化稳定性（ESI）的计算方法如下[9]：

式中：EAI为乳化活性指数，（m2/g）；T为2.303；A0为零时刻的吸光度值；C为蛋白质浓度，（g/mL）；φ为溶液中油的体积分数；ESI为乳化稳定性；A10为静置10 min后的吸光度值。

1.2.2.4 起泡性质

准确称取2 g米糠蛋白（酰化米糠蛋白），加入100mL水，置于装料杯中，在高速组织捣碎机中搅打1 min，迅速倒入500 mL量筒中，记录泡沫体积a；静置10 min后，再次测量泡沫体积b。起泡性与泡沫稳定性计算公式如下[10]：

1.3 统计分析

本研究中所有指标的数据均以平均值±标准偏差表示。采用Excel（2003）和Duncan's多重比较法进行数据统计分析，P＜0.05认为差异显著，P＜0.01认为差异极显著。用Excel（2003）软件绘制图示。

2 结果与讨论

2.1 琥珀酰化改性条件的确定

2.1.1 底物质量分数对酰化程度的影响

在琥珀酸酐/蛋白质添加量为10%、反应温度为25℃的条件下，考查米糠蛋白的底物浓度对琥珀酰化酰化度的影响，结果如图1。

图1 底物浓度对米糠蛋白酰化度的影响（n=3）Fig.1 The effect of substrate concentration on the degree of acylation of rice bran protein（n=3）

琥珀酸酐呈粉末状，不易溶于水，对于米糠蛋白的酰化改性的反应速率相对慢些。从图1中可以看出，在相同反应时间内，酰化度随着底物浓度的增加而逐渐增加，当米糠蛋白的浓度达到10%左右时，酰化度为47.8%，达到最大值。当米糠蛋白的浓度继续增加，酰化度呈现下降趋势。而且观察反应现象发现，当底物浓度在10%以上时，琥珀酰化改性过程中，蛋白质发生聚集沉淀现象。原因可能是过多的琥珀酸酐粉末加入到反应体系中，导致蛋白分子外面包裹的水化膜被去除，进而导致蛋白质分子发生聚集的现象，致使酰化反应无法进行下去，因此，当底物浓度大于10%时，酰化度呈逐渐下降的趋势。因此，将底物浓度10%确定为该反应体系的最适反应浓度。

2.1.2 反应温度对酰化程度的影响

反应温度对米糠蛋白的琥珀酰化也有一定的影响。在米糠蛋白浓度为5%、琥珀酸酐/蛋白质添加量为10%的条件下，考查反应温度对酰化度的影响，结果如图2所示。

图2 反应温度对米糠蛋白酰化度的影响（n=3）Fig.2 The effect of reaction temperature on the degree of acylation of rice bran protein（n=3）

从图2中可以看出，随着反应温度的增加，琥珀酰化对米糠蛋白的改性程度逐渐增加，酰化度逐渐提高，当反应温度为35℃时，酰化度达到44.6%。而当反应温度继续上升，发现酰化度呈下降趋势。这可能是由于，反应温度的升高，导致粉末状的琥珀酸酐加速了使米糠蛋白分子沉淀的现象，从而使酰化度降低。因此，在此反应体系中，确定35℃为最佳反应温度。

2.1.3 琥珀酸酐的用量对酰化程度的影响

当米糠蛋白浓度为5%、反应温度为25℃时，考查琥珀酸酐的用量对酰化程度的影响。其反应结果如图3所示。

图3 琥珀酸酐用量对米糠蛋白酰化度的影响（n=3）Fig.3 The effect of concentration of succinic anhydride on thedegree of acylation of rice bran protein（n=3）

通过图3中所示的结果，可以分析出，琥珀酰化的程度随琥珀酸酐添加量的增加而增加。当琥珀酸酐添加量为5%时，酰化度为29.9%，当琥珀酸酐添加量达到15%时，酰化度为34.6%。体系中的琥珀酸酐浓度的增加，琥珀酸酐分子与米糠蛋白分子的碰撞几率变大，反应速率增加，引起了米糠蛋白琥珀酰化程度增加，因此酰化度有所提高，这一现象符合化学反应规律。但从结果中不难发现，琥珀酸酐的添加量由5%增加至15%时，酰化度的增加幅度不大，而当琥珀酸酐的添加量继续增加，当添加量增加到20%时，酰化度呈下降趋势。原因可能是琥珀酸酐添加量的增大，溶于水中的琥珀酸酐浓度也相应增加，结果导致米糠蛋白的变性，最终阻碍了酰化反应的进行。因此，综合考虑，本实验中，将琥珀酸酐的最适添加量确定为15%。

在上述最适反应条件下进行酰化反应，反应分别进行40、80 min制备琥珀酰化米糠蛋白1、琥珀酰化米糠蛋白2制品备用，两种酰化蛋白制品的酰化度分别为46.8%、69.2%。

2.2 酰化米糠蛋白功能性质的测定

2.2.1 溶解性

2.2.1.1 溶解性标准曲线

根据1.2.2.2的方法测定，以牛血清白蛋白质量为横坐标，吸光值A540为纵坐标绘制标准曲线。如图4

吸光值（y）和牛血清白蛋白质量（x）的直线方程为：y=2.538x+0.039 6，R2=0.994 8，线性关系良好，可以用于蛋白质含量的计算。

2.2.1.2 琥珀酰化米糠蛋白的溶解性

米糠蛋白与两种琥珀酰化米糠蛋白，在pH3～10条件下的氮溶解指数（NSI）见图5所示。

图4 牛血清白蛋白溶解性标准曲线Fig.4 The standard curve of solubility of bovine serum albumin

图5 不同pH条件下米糠蛋白及琥珀酰化米糠蛋白溶解性（n=3）Fig.5 Solubiligy of rice bran protein and succinic anhydrided rice bran protein products at different pH（n=3）

从图5中，可以明显得出结果，在大于等电点的pH范围内，琥珀酰化米糠蛋白的溶解性高于米糠蛋白的溶解性，并且琥珀酰化米糠蛋白的溶解性随着酰化度的增大而显著提高。米糠蛋白与琥珀酰化米糠蛋白溶解性的最低点，即等电点，稍有不同。从图中明显看出，琥珀酰化米糠蛋白的等电点略向pH＜5方向，即向酸性方向移动，大约在pH=4附近，并且在pH＜pI范围内，琥珀酰化米糠蛋白的溶解度略低于米糠蛋白的溶解度。

2.2.2 乳化性质

对琥珀酰化米糠蛋白的乳化活性指数及乳化稳定性也进行了相关评价，结果如图6、图7所示。

由图6可知，针对米糠蛋白和琥珀酰化米糠蛋白制品的四个蛋白质浓度进行研究。与相同浓度的米糠蛋白相比，两种琥珀酰化米糠蛋白乳状液的乳化活性指数均略有降低，琥珀酰化米糠蛋白1的乳化活性指数为45.1 m2/g～11.1 m2/g蛋白，琥珀酰化米糠蛋白2的乳化活性指数为42.7 m2/g～10.7 m2/g蛋白，比米糠蛋白的乳化活性指数51.3 m2/g～24.8 m2/g蛋白略低。

图6 米糠蛋白与琥珀酰化米糠蛋白的乳化活性指数（n=3，P＜0.01）Fig.6 Emulsifying activity index of rice bran protein and succinic anhydrided rice bran protein products（n=3，P＜0.01）

图7 米糠蛋白与琥珀酰化米糠蛋白的乳化稳定性（n=3，P＜0.01）Fig.7 Emulsifying stability index of rice bran protein and succinic anhydrided rice bran protein products（n=3，P＜0.01）

从图7中可以看出，两种琥珀酰化米糠蛋白制品的乳化稳定性都比相同浓度下得米糠蛋白的乳化稳定性高，尤其是在高浓度下，琥珀酰化米糠蛋白较米糠蛋白而言具有非常高的乳化稳定性。当蛋白质浓度为0.03%时（w/v），琥珀酰化米糠蛋白1和琥珀酰化米糠蛋白2的乳化稳定性接近105%，而米糠蛋白的乳化稳定性仅为55%。这一结果显示了，经过琥珀酸酐改性的米糠蛋白制品提高了乳化稳定性，而削弱了乳化活性。

蛋白质分子聚集在油滴表面降低了油水界面的表面张力并形成一层保护层，并且，通过静电斥力的作用阻止了油滴间的聚合，因而起到一定的乳化作用，而且吸附动力学可以解释乳化活性指数对蛋白质浓度的依赖，即在较低的蛋白浓度下，蛋白质在油水界面属于扩散控制；在较高蛋白浓度下，活化能将限制蛋白质迁移[11]，因此，乳化活性指数会随着蛋白质浓度的增加逐渐减小。与米糠蛋白相比，琥珀酰化米糠蛋白的乳化活性指数有所降低，是由于琥珀酰化米糠蛋白所含的羧基含量增加，导致疏水性降低，从而提高了界面张力。

2.2.3 起泡性

由图8可知，同等浓度下，琥珀酰化的起泡性比米糠蛋白的起泡性有所提高，并且随着酰化度的增加，起泡性也随之增加，而泡沫稳定性随着酰化度的增加而有所降低。本研究中，酰化米糠蛋白2的起泡性为226.2%，为米糠蛋白起泡性的2.8倍；而米糠蛋白的泡沫稳定性为56.7%，琥珀酰化米糠蛋白2的泡沫稳定性仅为14.2%。究其原因，起泡性的提高是由溶解性的提高引起的。

国外已有很多研究证实，在食用价值上，酰化蛋白是无毒易消化的。Groninger和Miller[12]在研究中发现，赖氨酸残基被酰化后，用来喂养鼠类时，营养价值几乎没有损失。因此，琥珀酰化不会降低米糠蛋白的利用效果和营养价值，是一种潜在的食品添加基料。

图8 米糠蛋白与酰化米糠蛋白的泡沫性质（n=3）Fig.8 Foam properties of rice bran protein and acylated rice bran protein products（n=3）

3 结论

1）琥珀酰化改性米糠蛋白的最适反应条件确定为米糠蛋白浓度为10%，反应温度为35℃，琥珀酸酐/蛋白质用量为15%。

2）琥珀酰化改性对米糠蛋白的一些功能性质有了不同程度的改变，其中琥珀酰化改性提高了米糠蛋白的溶解性、乳化稳定性及起泡性，并随着酰化度的增加而增加；而米糠蛋白的乳化活性以及泡沫稳定性由于酰化改性而有所下降。可以作为食品中的添加基料，扩大米糠蛋白在食品加工业的应用范围。

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Effect of Succinylated Modification on the Functional Properties of Rice Bran Protein

ZHAI Ai-hua1，MA Guo-fei1，2，LI Dan1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China；2.Organization Department，Chinese Communist Friendship County，Shuangyashan 155800，Heilongjiang，China）

Succinic anhydride was applied in the present work to treat rice bran protein for succinylated modification for improving the functional properties of rice bran protein and expanding the application in food industry.The concentration of rice bran protein of 10%，the reaction temperature of 35℃and succinic/protein addition level of 15%was determined for the optimum reaction conditions through single factor reaction.Two succinylated rice bran protein products prepared with reaction time of 40 min and 80 min had the degree of acylation of 46.8%and 69.2%.Some functional properties of two succinylated rice bran protein products，such as solubility，emulsification，foaming ability，were analyzed.The results indicated that solubility，emulsion stability and foaming ability of two succinylated rice bran protein products were higher than that of rice bran protein and emulsifying activity and foam stability of two succinylated rice bran protein products were lower than that of rice bran protein as degree of acylation increased.

Succinylation；rice bran protein；functional properties

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.001

2013-09-25

高端配方米加工及副产物综合精深加工技术产业化示范（HNK11KF-01）

翟爱华（1970—），女（汉），教授，硕士，主要从事粮油精深加工的研究。