乳腺癌中P53的表达与上皮-间质转化的相关性及其临床意义*

2014-07-02霍莉莉任秀宝

中国肿瘤临床 2014年12期

霍莉莉李慧魏枫任秀宝

霍莉莉李慧魏枫任秀宝

目的：探讨乳腺癌组织中P53的表达和上皮-间质转化（EMT）的相互关系及其临床意义。方法：免疫组织化学法检测63例乳腺癌组织中P53、Twist、Snail、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin的表达情况，分析乳腺癌突变型P53蛋白表达与临床病理特征，患者预后和EMT发生之间的关系。结果：P53、Twist和Snail的阳性率以及EMT的发生率分别为44.4%（28/ 63）、54.0%（34/63）、68.3%（43/63）和41.3%（26/63）。乳腺癌P53表达与组织学分级相关（P＜0.05），与其他临床病理特征无关（P＞0.05）。P53与Twist、Snail的表达存在相关性，而Twist、Snail和EMT发生相关（P＜0.05）。多因素分析显示，淋巴结转移、P53和EMT是乳腺癌患者预后的独立影响因素。结论：P53的表达与乳腺癌组织学分级和EMT的发生相关，是患者预后的独立影响因素，可作为乳腺癌治疗的重要靶点。

乳腺肿瘤 P53 上皮-间质转化预后免疫组织化学

cer,and3Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy,Tianjin,Tianjin 300060,China

This work was supported by the Tianjin Municipal Application Foundation and Cutting-edge Technology Research Project(No.12JCYBJC16100)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展是多基因改变和环境因素联合作用的结果。其中，P53突变是常见的基因改变之一，研究发现突变型P53的表达与乳腺癌预后不良相关［1］。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指具有极性的上皮细胞转化成为间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程，目前研究认为EMT是肿瘤细胞发生侵袭与转移的重要机制［2-3］。本研究采用免疫组织化学法检测P53和EMT标志物在人乳腺癌组织中的表达水平，探讨P53和EMT之间的相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 患者资料所有标本均取自天津医科大学肿瘤医院乳腺外科2003年7月至2007年7月手术切除的浸润性乳腺癌组织共63例，经病理确诊均为非特殊型浸润性导管癌。患者均为女性，年龄27～69岁，中位年龄49岁。手术前均未接受过抗癌治疗（包括放疗、化疗及内分泌治疗等）。患者术后分期：Ⅰ期4例，ⅡA期24例，ⅡB期20例，ⅢA期7例，ⅢB期2例，ⅢC期5例，Ⅳ期1例。组织学分级：Ⅰ级3例，Ⅱ级42例，Ⅲ级18例。ER（+）14例，PR（+）12例，HER-2（+）39例。术后辅助化疗、放疗及内分泌治疗。随访时间从手术切除时间开始到死亡或2013年3月。本研究取得受试者知情同意，符合伦理学标准。

1.1.2 主要试剂 P53鼠抗人单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Twist兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，Snail兔抗人多克隆抗体购自英国Abcam公司。E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Fibronectin鼠抗人单克隆抗体购自美国BD公司。EliVision plus检测试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法检测乳腺癌组织P53、Twist、Snail和EMT标志物的表达标本经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，常规HE染色及免疫组织化学染色。石蜡切片常规脱蜡水化，P53抗体采用EDTA（pH8.0）、其他抗体采用柠檬酸钠缓冲液热抗原修复，3%H2O2室温孵育20 min阻断内源性过氧化物酶活性。滴加一抗，4℃孵育过夜。滴加增加剂，湿盒室温孵育20 min。滴加酶标记的二抗，湿盒室温孵育30 min。DAB显色，苏木精对比染色。常规酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。以PBS代替一抗行阴性对照。

西方国家的社会救助权建立在生存权之上，这也决定了社会救助权的构成要件相对简单，即只要以自身能力无法维持最低生活标准的公民即可向国家申请社会救助。举例而言，美国的社会救助可以分为特殊救助（SA）和一般救助（GA）两类，但两者均要求社会救助权的行使需具备符合贫困标准以及自身或家庭难以完成脱贫两个要件[10]，相似的，日本的生活保护制度也对社会救助权设定了符合保护基准和家庭保护不能两个要件。[11]122-126基于上文指出的我国社会救助权与西方国家在宪法基点上的不同，其要件构成也具有一定的差异性，而这种差异性也是在法律与政策的互动中得以呈现。

1.2.2 阳性结果判断 1）P53阳性结果判断：P53以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数≥10%为阳性切片。2）Twist和Snail阳性结果判断：半定量判断免疫组织化学结果，光镜下随机观察10个高倍镜视野，每个视野计数100个肿瘤细胞。按着色程度评分：0分为无着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；按阳性细胞所占比例评分：0分为＜10%，1分为10%～24%，2分为25%～49%，3分为≥50%。以两者之和判定结果，0～2分为阴性，3～6分为阳性。3）EMT阳性结果判断：E-Cadherin以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数＞50%为阳性切片；N-Cadherin以细胞膜和（或）细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数＞1%为阳性切片；Vimentin以细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数＞1%为阳性切片；Fibronectin以细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性表达，阳性细胞数＞1%为阳性切片。其中E-Cadherin为上皮细胞标志物，N-Cadherin、Vimentin和Fibronectin为间质细胞标志物。上皮细胞标志物表达阴性或者任一间质细胞标志物表达阳性计为EMT阳性。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 18.0统计软件进行Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验和χ2检验，采用偏相关分析和二元Logistic回归分析进行相关性分析，运用单因素Kaplan-Meier生存分析和多因素Cox生存分析模型分析影响乳腺癌患者预后的相关因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P53、Twist、Snail和EMT标志物的表达情况

P53的表达主要位于细胞核，在检测的63例标本中有28例表达阳性，阳性表达率为44.4%。Twist主要定位于细胞质，少数细胞核中亦有表达，阳性表达率为54.0%（34/63）。Snail定位于细胞核，阳性表达率为68.3%（43/63）。E-Cadherin表达于细胞膜和细胞质，其阳性表达率为74.6%（47/63）。N-Cadherin表达于细胞膜和（或）细胞质，其阳性表达率为38.1%（24/63）。Vimentin表达于细胞质，其阳性表达率为23.8%（15/63）。Fibronectin表达于细胞膜，其阳性表达率为7.9%（5/63）。根据EMT发生的判定标准，EMT阳性率为41.3%（26/63，图1）。

图1 免疫组织化学法检测P53、Snail、Twist和EMT标志物的表达情况（IHC×400）Fig 1 Immune staining detected the expression of P53,Snail,Twist and markers of EMT（IHC×400）

2.2 乳腺癌P53的表达与患者临床病理特征的关系

比较乳腺癌组织P53蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、pTNM分期、ER、PR、HER-2的关系，发现其与组织学分级有关（P＜0.05），组织学Ⅲ级患者的P53表达率明显高于Ⅰ、Ⅱ级患者。P53的表达与其他临床病理特征无关（P＞0.05，表1）。

2.3 P53的表达和EMT发生与乳腺癌患者的预后分析

单因素分析显示，淋巴结转移、P53和EMT与患者预后相关，而年龄、肿瘤大小、组织学分级、pTNM、ER、PR、HER-2、Twist和Snail与预后无关（表2）。多因素分析显示，淋巴结转移、P53和EMT是患者预后的独立影响因素。

表1 63例乳腺癌P53的表达与临床病理特征的关系Table 1 Correlation between expression of P53 and clinicopathologic features of breast carcinoma

表2 乳腺癌患者预后影响因素Table 2 Univariate analysis of overall survival

2.4 P53、Twist、Snail和EMT发生的相关性

应用二元Logistic回归分析P53、Twist、Snail和EMT发生的关系。以EMT为因变量Y，P53、Twist和Snail为自变量X，建立Logistic回归模型：Logit（p）=-3.076+2.069×Twist+1.914×Snail。Logistic回归模型似然比检验结果差异有统计学意义（P＜0.001），回归系数Wald χ2检验显示P＜0.05。Twist优势比OR=7.915（2.089，29.990），Snail优势比OR=6.782（1.254，36.688），因此可以认为Twist和Snail是EMT发生的危险因素，即Twist和Snail的表达可以促使EMT发生。在控制EMT的条件下进行P53与Twist，以及P53与Snail的偏相关分析，发现均呈正相关（P＜0.001）。可据此认为在消除EMT影响的条件下，乳腺癌P53与Twist和Snail的表达间存在相关性。

3 讨论

p53基因定位于17p13.1，其编码的P53蛋白在DNA损伤修复、细胞凋亡和细胞周期阻滞等生物效应中发挥重要作用［4］。在肿瘤发生过程中，p53是最常见的突变基因之一。突变型P53不能有效激活P53下游的DNA损伤应激反应途径，从而失去了肿瘤抑制功能。免疫组织化学是检测肿瘤组织P53表达水平的常用手段。因野生型P53蛋白的半衰期较短，免疫组织化学法无法检测到；而突变型P53半衰期增长，因此免疫组织化学法检测到的P53均为突变型P53［5］。本研究发现随着乳腺癌组织学分级的升高，P53的表达率增加，说明P53与乳腺癌的恶性程度有关。有研究也报道P53的表达与乳腺癌组织学分级相关，是患者预后不良的独立预测因素之一［1］。

上皮细胞经历EMT过程后会出现细胞间连接消失、细胞游走和侵袭能力增强。因此，肿瘤细胞经历EMT是肿瘤发生浸润转移的重要途径［6-7］，而探讨EMT的发生机制和影响因素对于减少肿瘤转移，延长患者生存时间具有重要意义。目前认为转录因子Twist和Snail在EMT的发生过程中具有重要作用。肿瘤细胞高表达Twist和Snail，可以抑制E-Cadherin等上皮标志物的转录，同时上调N-Cadherin等间质标志物的表达水平，从而介导EMT的发生［7-8］。本研究也发现，乳腺癌组织表达Twist和Snail能够促进EMT的发生。

近年来有学者提出P53也参与调控EMT过程。有研究认为，P53可以通过激活miR-200、miR-192和miR-34等microRNA，降低ZEB1、ZEB2和Snail的表达，从而抑制EMT的发生［9-11］。因此，在p53基因突变的肿瘤细胞会出现P53功能缺失，从而促进EMT的发生。不仅如此，近年来研究发现某些突变型P53还具有获得性功能，可以抑制野生型P53的活性或者诱导某些基因表达进而促进肿瘤的发生［4，12］。在子宫内膜癌，突变型P53能够直接结合miR-130b的启动子，抑制其转录，从而上调ZEB1的表达水平，促进EMT的发生并增强细胞的侵袭能力［13］。肺癌p53基因突变与Slug高表达和E-Cadherin低表达有关。沉默高侵袭性NSCLC细胞系中突变型P53的表达，能够显著降低Slug的水平，增加E-cadherin的表达，同时降低细胞侵袭能力。重新表达Slug能够逆转这些变化［14］。Zhang等［15］发现突变型P53能够诱导MCF-10A发生EMT。在乳腺癌MCF7细胞转入R175H和R273H两种突变型P53会出现Snail1蛋白表达增加、E-Cadherin表达下降，同时细胞侵袭能力增加；沉默表达突变型P53的MDA-MB-231的Snail1的表达或者异位表达miR-34a，都能够抑制细胞的侵袭特性，诱导上皮细胞标志物的再表达同时下调间质细胞标志物的水平［16］。上述研究表明突变型P53具有获得性功能，能够诱导肿瘤细胞发生EMT。但是这些研究主要探讨了肿瘤细胞系表达突变型P53可以诱导EMT的发生，提高肿瘤细胞的侵袭和转移能力，而关于肿瘤标本中突变型P53和EMT的相关性少有报道。因此，本研究以乳腺癌组织标本为研究对象，发现乳腺癌患者突变型P53的表达与转录因子Twist和Snail的表达呈正相关，而据上文所述Twist和Snail能促进EMT的发生。生存分析发现突变型P53和EMT均为乳腺癌预后的独立影响因素。据此推测乳腺癌患者可能通过表达突变型P53上调Twist和Snail的表达，后者诱导肿瘤细胞发生EMT，进而促进转移，影响预后。Coradini等［17］发现存在p53基因突变的乳腺癌其编码顶端连接复合体的基因INADL、JAM2、JAM3、MAGI1、PARD6B和PVRL2的表达显著下调，同时有编码N-Cadherin的基因CDH2和细胞增殖与转移相关基因CCNE2、CDK4、CDK6、MKI67和MTA1的过表达，进一步支持了上述结论。

目前，乳腺癌的复发和转移仍然是威胁患者生存的重要原因。突变型P53参与乳腺癌发生发展的多个环节，能够促进肿瘤的浸润转移，因此，针对突变型P53的治疗策略很可能达到抑制肿瘤细胞转移的效果，成为肿瘤治疗的新思路。

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（2014-04-11收稿）

（2014-06-04修回）

（本文编辑：周晓颖）

Correlation and clinical significance of P53 expression with epithelial-mesenchymal transition in breast cancer

Lili HUO1,2,3,Hui LI1,2,3,Feng WEI1,2,3,Xiubao REN1,2,3
Correspondence to:Xiubao REN;E-mail:rwziyi@yahoo.com

Objective:This study aims to investigate the correlation and significance between the expression of P53 and epithelial-mesenchymal transition(EMT)in breast cancer.Methods:The expression patterns of P53,Twist,Snail,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,and Fibronectin protein were detected via immunohistochemistry in 63 cases with breast carcinoma.The correlation of P53 protein with clinicopathologic features and survival of breast carcinoma,as well as the relationship between the expression of P53 and EMT,was analyzed.Results:The expression rates of P53,Twist,Snail,and EMT are 44.4%(28/63),54.0%(34/63),68.3%(43/63), and 41.3%(26/63),respectively.The P53 protein expression is correlated with tumor grade(P＜0.05)but not with other clinicopathologic features(P＞0.05).The expression of P53 is also correlated with the expression of Twist and Snail,which are associated with EMT (P＜0.05).Multivariate survival analysis reveals that lymph node metastasis,P53,and EMT are independent prognostic factors.Conclusion:The expression of P53 is correlated with tumor grade and EMT in breast cancer,which can be used as an independent prognostic factor.Therefore,P53 may be an effective target for breast cancer therapy.

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