miR-194慢病毒表达质粒的构建及对人骨肉瘤细胞系U2-OS转移的相关研究*

2014-07-02赵廷宝蔡成魁颜世举琼沙杨彤涛马保安

中国肿瘤临床 2014年12期

韩康赵廷宝卞娜蔡成魁颜世举王鑫马琼沙浩董川杨彤涛周勇马保安

·基础研究·

韩康①②赵廷宝②卞娜①蔡成魁①颜世举①王鑫①马琼①沙浩①董川①杨彤涛①周勇①马保安①

目的：通过构建携带针对miR-194的慢病毒沉默及过表达载体，研究miR-194对骨肉瘤细胞转移的影响。方法：以miR-194前体及成熟体序列为模板，设计引物，进行PCR扩增，酶切后克隆于慢病毒载体plent-i GFP中，转染293T细胞，包装慢病毒颗粒，检测滴度，最终对人骨肉瘤细胞系U2-OS进行感染。获取稳定感染细胞后，进行Transwell、划痕等实验。结果：1）慢病毒表达质粒构建成功，沉默表达及过表达重组慢病毒的滴度分别为4×108TU/mL及1.5×108TU/mL；2）稳定过表达miR-194的人骨肉瘤细胞系U2-OS的转移能力较其他组有明显降低（P＜0.01）。结论：成功构建了miR-194慢病毒表达载体，miR-194的表达水平对U2-OS细胞的转移能力具有显著影响，miR-194可能成为骨肉瘤治疗的潜在新靶点。

骨肉瘤 miR-194 慢病毒成骨肉瘤细胞系U2-OS 转移

1Center of Orthopedic Surgery and Osseous Tumor Institute of People's Liberation Army(PLA),Tangdu Hospital,Fourth Military

Medical University,Xi'an 710038,China;2Department of Spinal Cord Injury,General Hospital of Ji'nan Military Command of

PLA,Jinan 250000,China

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81201633)

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一类高度恶性，起源于间叶组织的实体肿瘤。在儿童和青少年期比较多见，预后极差，有约50%的患者可于数月内出现肺部转移，并成为骨肉瘤患者死亡的最主要原因［1-2］。目前的临床治疗以手术为主，化疗为辅。但容易产生复发及耐药，且经济和社会负担沉重［3］。microRNAs是一组长为18～24 nt的单链非编码小分子RNA，广泛存在于包含动植物在内的多种真核生物中［4-5］。对细胞凋亡、增殖、转移等水平调控基因组的表达起到调控作用，参与一系列重要生命过程进程［6］。已有文献报道miRNAs表达异常与恶性肿瘤的发生和转移有密切关系［7-8］。本研究通过构建miR-194沉默及过表达慢病毒质粒载体，初步研究miR-194对于骨肉瘤细胞系U2-OS转移的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人成骨肉瘤细胞系U2-OS购于北京创联生物技术有限公司。shRNA及阴性对照载体pLKO.1-TRCCloning Vector购于美国Addgene公司，表达质粒载体pLVX-AcGFP1-N1购自美国Clontech公司。RPMI 1640培养基、高糖DMEM去血清培养基购自美国Gibco公司，胰蛋白酶消化液购自西安碧云天生物技术公司。5415C台式离心机来自德国Eppendorf公司，positive clone测序购自上海美季生物技术公司，DYCP-31CN琼脂糖水平电泳仪来自上海茸研仪器有限公司，HF151UV CO2细胞培养箱自购美国Thermo公司，Gilson移液器来自美国吉尔森公司，转染试剂LipofectamineTM2000购自美国Rnvitrogen公司，Trans well小室购自美国corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养成骨肉瘤细胞系U2-OS细胞采用高糖DMEM培养液（含l0%胎牛血清），在37℃、5% CO2饱和湿度的孵箱条件下传代培养，实验用细胞均在其对数生长期提取。

1.2.2 miR-194慢病毒载体的构建 1）引物设计及合成：通过Sanger microRNA序列数据库获得miR-194前体及成熟体序列。前体hsa-miR-194-1：5'-AUGGUGUU AUCAAGUGUAACAGCAACUCCAUGUGGACUGUGUA CCAAUUUCCAGUGGAGAUGCUGUUACUUUUGAUGG UUACCAA-3'，其引物为：5'-AGCTGTACAAGTAAGAG AACATGAATAAATCGAGAC-3'；成熟体 hsa-mi R-194-5p：5'-UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA-3'，其引物为：5'-CCATGATT CCTTCATATTTGC-3'。引物由上海吉凯生物工程有限公司合成。2）前体及成熟体基因的扩增：将相关引物退火后形成二聚体，再以其为模板进行扩增。反应条件为：98℃预变性3 min，98℃变性10 s，54.5℃退火15 s，72℃延伸30 s，30个循环，4℃保存。3）重组慢病毒载体的构建：纯化回收相应的PCR产物，胶回收其基因片段。按化学合成法在其两段添加5'和3'端。制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞，将miRNA片段连接并转化。进行阳性克隆的PCR鉴定及阳性克隆测序结果及结果分析。4）慢病毒包装、收获、浓缩及滴度的测定：将293T细胞接种于培养皿中并培养，利用脂质体LipofectamineTM2000将表达及包装质粒转入293T细胞中，48 h后离心过滤分装。采用梯度荧光稀释法，将293T细胞接种于96孔板中，加入病毒液，于显微镜下观察GFP的表达，计算病毒滴度（TU/mL）=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/0.1。5）MOI值及最佳筛选浓度测定：感染U2-OS细胞进行相关预实验，检测慢病毒感染骨肉瘤U2-OS细胞的最佳感染浓度（MOI值），并检测嘌呤霉素的最佳筛选浓度，对U2-OS细胞进行感染并筛选。6）miR-194表达的测定：对4组转染并筛选的U2-OS细胞提取总RNA，使用RT-PCR的方法对miR-194的表达进行测定，U6作为管家基因。

1.2.3 Transwell侵袭实验 1）Transwell小室的包被：实验前一天，将Matrigel稀释液放入4℃过夜。所用枪头及试管预冷。实验时将Matrigel稀释为1：8后加入各小室膜的表面，放入孵箱中。2）水化基底膜：将残余液体吸出，加入50 μL/孔的无血清培养液，再放入孵箱中30 min。3）制备细胞悬液：将4组转染后稳定表达的细胞（上调、空白病毒对照、未转染、下调）取对数期，消化、冲悬、离心、用未加血清的培养基冲悬稀释计数，使其密度为5×105个/mL。4）接种细胞：将计数好的各组细胞吹匀后往各小室加入200 μL，使其细胞数量为1×105个细胞。每个小室的下室中加入600 μL含10%血清的培养基，将24孔板放入孵箱16 h。5）细胞固定、染色及计数：用棉签擦去小室上层的细胞，加入95%酒精固定15 min，倒置风干。每孔中加入0.1%结晶紫溶液染色15 min后用PBS清洗。于显微镜下随机抽取6个视野，计数并拍摄。

1.2.4 Transell迁移实验迁移实验和侵袭实验的实验方法基本相同，唯一区别在于不需要对Transwell小室进行包被和水化。

1.2.5 划痕实验 1）实验准备：实验前将包含直尺、Marker笔在内的所有器械灭菌消毒30 min。用Marker笔在6孔板下底面均匀划横线，每隔0.5 cm一道。2）制备细胞悬液并铺板：将4组转染后稳定表达的细胞（上调、空白病毒对照、未转染、下调）取对数期，消化、冲悬、离心、用含有血清的培养基冲悬稀释计数后加入各孔中，使数量为1.5×105个细胞/孔。放入孵箱中培养24 h。3）划痕并拍照：使用PBS将细胞洗涤3遍后，10 μL枪头比照所划横线，垂直划细胞，用PBS清洗后，加入含血清培养基，拍照后，放入孵箱培养，后6、12、24、48 h取样，拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-194慢病毒载体的构建

2.1.1 miR-194基因扩增产物的鉴定经电泳分析，可见特异性条带，则慢病毒载体构建成功（图1）。

2.1.2 滴度的测定将包被好的慢病毒载体利用荧光法进行滴度的测定，其过表达慢病毒滴度为1.5× 108TU/mL，抑制过表达慢病毒滴度为4×108TU/mL。

2.1.3 感染复数（multiply of infection，MOI）值测定 U2-OS预实验显示，过表达病毒的MOI值为100 TU/mL，抑制过表达及空白病毒对照的MOI值为50 TU/mL。

2.1.4 嘌呤霉素筛选及获取目的细胞 U2-OS预实验可见，将慢病毒感染过的细胞用不同浓度的嘌呤霉素进行筛选后发现最佳筛选浓度为0.5 μg/mL，抑制过表达及空白对照慢病毒转染细胞最佳筛选浓度为1 μg/mL。经筛选后获得目的细胞，转染及筛选效率＞90%（图2A，2B）。

2.1.5 目的细胞中miR-194水平的测定和验证将获取的4组感染后并经过筛选的U2-OS细胞，提取总RNA，使用RT-PCR的方法，对miR-194水平进行测定，结果显示miR-194过表达组的miR-194水平表达明显高于其余3组（P＜0.01）。抑制表达组的miR-194水平远远低于其余3组（P＜0.01），而空白对照组与未转染组之间无显著性差异（图2C）。以上结果说明，使用慢病毒载体对骨肉瘤细胞系U2-OS细胞进行关于miR-194调控的转染成功，能够有效的调控miR-194的表达量，从而为进一步的实验打下了良好的基础。

2.2 miR-194对U2-OS细胞在Transwell迁移实验中的影响

4组细胞按照同样的浓度和条件种植于Transwell小室上层，16 h后用酒精固定，并用结晶紫染料进行染色，在显微镜下随机选取6个视野进行数目的测定。结果显示，同其他组相比miR-194上调组细胞的迁移能力明显下降（24.30±2.51，P＜0.05），下调组迁移能力明显上升（214.60±9.35，P＜0.05）。而未转染细胞组（88.20±6.59）与空白病毒对照组（83.00±7.34）细胞的增殖能力无显著性差异（P＞0.05，图3A，3C）。以上结果说明，miR-194对于U2-OS细胞的增殖能力有明显的抑制作用。

图1 miR-194过表达电泳图（A）及miR-194抑制表达电泳图（B）Figure 1 Electrophoretogram of miRNA-194

图2 骨肉瘤U2-OS细胞经转染筛选后，用RT-PCR的方法对miR-194的表达进行测量*P＜0.05Figure 2 Measurement of miR-194 expression after transfection in U2-OS cells through RT-PCR

2.3 miR-194对U2-OS细胞侵袭能力的影响

4组细胞以同样浓度种植于经包被和水化的Transwell小室上层，16 h后用酒精固定，并用结晶紫染料染色，在显微镜下随机选取6个视野进行数目的测定。结果显示，同其他组相比miR-194上调组细胞的侵袭能力明显下降（21.00±2.23，P＜0.05），下调组侵袭能力明显上升（199.20±7.72，P＜0.05）。而未转染细胞组（77.00±8.30）与空白病毒对照组细胞（85.00± 4.12）的侵袭能力无显著性差异（P＞0.05，图3B，3D）。以上结果说明，miR-194对于U2-OS细胞的侵袭能力有明显的抑制作用。

2.4 miR-194对U2-OS细胞在划痕实验中的影响

将含有不同miR-194表达的4组细胞以相同的浓度种植于孔板中，在相同的时间以相同的宽度，进行划痕实验。然后再孵育24、48 h后镜下观察和拍照。结果显示，同其他组相比miR-194上调组细胞的划痕愈合能力明显下降（0.43±0.12）U（P＜0.05），下调组划痕愈合能力明显上升（0.051±0.08）U（P＜0.05）。而未转染细胞组（0.19±0.08）U与空白对照组细胞（0.21±0.05）U的侵袭能力无显著性差异（P＞0.05）。48 h时，下调组细胞划痕已基本愈合，而其他3组在同一时间仍有较大划痕显露（图4）。以上结果显示，miR-194对于骨肉瘤细胞U2-OS的迁移能力和愈合能力有明显的抑制作用。

图4 骨肉瘤U2-OS细胞划痕实验结果（*P＜0.05）Figure 4 Representative photographs of migrated U2-OS cells in wound healing assay.*P＜0.05

3 讨论

随着分子生物学及相关技术的发展，人们已形成后基因组时代主要表现为RNA的调控的共识。其中，miRNA毫无疑问是一颗冉冉升起的新星，具有在转录后水平或翻译水平调控基因表达的功能［9］。哺乳动物中，miRNA控制着30%左右编码蛋白基因的表达。据统计，miRNAs调节着人类约1/3的基因，对人类生命现象发挥着巨大的作用。miRNA作用主要表现在如下方面：胚胎发生，发育时序，器官分化，程序性细胞死亡和生长控制（癌症）［10］。已有很多文献报道，miRNAs对于多种肿瘤发挥着癌基因或者抑癌基因的作用，miRNA可能成为肿瘤治疗的新靶点［10］。

miR-194是众多miRNA分子中的一个，在许多肿瘤中都异常表达［11-12］。如结肠癌［13］、食管癌［14］等消化道肿瘤细胞中，miR-194的异常表达尤为明显。Venugopal等［15］研究表明，miR-194在肝肿瘤的发生及转移中发挥着重要的作用，可作为肝上皮细胞的标志物，并有可能与动物的昼夜节律相关。同时，miR-194还有可能受p53基因的调节。而众所周知，p53基因的表达异常与肿瘤的发生、发展，转移等有着极其密切的关系［16］。骨肉瘤是一类发病率很高的恶性肿瘤，目前的临床治疗主要是依靠化疗和手术治疗结合的方法进行［17］。

目前对miR-194如何调控骨肉瘤细胞转移的作用机制以及在生物体内的验证有待进一步深入的研究。如能在一定数量的临床样本中（含石蜡样本）测定miR-194的含量并进行相关分析，更能增加实验的严谨性和科学性。同时，miR-194的体内作用机制到底如何，其下游靶基因有哪些，具体作用如何，值得进一步的研究和探索。尽管miR-194对骨肉瘤细胞转移的调控机制仍需要更加深入的研究和探索，但本研究却为以miR-194为靶基因的骨肉瘤生物靶向治疗提供了一定的理论依据。

1 Clark JC,Dass CR,Choong PF.A review of clinical and molecular prognostic factors in osteosarcoma[J].J Cancer Res Clin Oncol, 2008,134(3)：281-297.

2 Kansara M,Thomas DM.Molecular pathogenesis of osteosarcoma [J].DNA Cell Biol,2007,26(1)：1-18.

3 Osborne TS,Khanna C.A review of the association between osteosarcoma metastasis and protein translation[J].J Comp Pathol,2012, 146(2-3)：132-142.

4 Ambros V.Micrornas：Tiny regulators with great potential[J].Cell, 2001,107(7)：823-826.

5 Bartel DP.Micrornas：Genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2)：281-297.

6 Godshalk SE,Paranjape T,Nallur S,et al.A variant in a microrna complementary site in the 3'utr of the kit oncogene increases risk of acral melanoma[J].Oncogene,2011,30(13)：1542-1550.

7 Zhang B,Pan X,Cobb GP,et al.Micrornas as oncogenes and tumor suppressors[J].Dev Biol,2007,302(1)：1-12.

8 Cheng Q,Yi B,Wang A,et al.Exploring and exploiting the fundamental role of micrornas in tumor pathogenesis[J].Onco Targets Ther,2013,6：1675-1684.

9 Inui M,Martello G,Piccolo S.Microrna control of signal transduction[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2010,11(4)：252-263.

10 Tazawa H,Kagawa S,Fujiwara T.Micrornas as potential target gene in cancer gene therapy of gastrointestinal tumors[J].Expert Opin Biol Ther,2011,11(2)：145-155.

11 Georges SA,Biery MC,Kim SY,et al.Coordinated regulation of cell cycle transcripts by p53-inducible micrornas,mir-192 and mir-215[J].Cancer Res,2008,68(24)：10105-10112.

12 Song B,Wang Y,Kudo K,et al.Mir-192 regulates dihydrofolate reductase and cellular proliferation through the p53-microrna circuit [J].Clin Cancer Res,2008,14(24)：8080-8086.

13 Song B,Wang Y,Titmus MA,et al.Molecular mechanism of chemoresistance by mir-215 in osteosarcoma and colon cancer cells[J]. Mol Cancer,2010,9：96.

14 Krutzfeldt J,Rosch N,Hausser J,et al.Microrna-194 is a target of transcription factor 1(tcf1,hnf1alpha)in adult liver and controls expression of frizzled-6[J].Hepatology,2012,55(1)：98-107.

15 Venugopal SK,Jiang J,Kim TH,et al.Liver fibrosis causes downregulation of mirna-150 and mirna-194 in hepatic stellate cells, and their overexpression causes decreased stellate cell activation[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2010,298(1)：G101-106.

16 Pichiorri F,Suh SS,Rocci A,et al.Downregulation of p53-inducible micrornas 192,194,and 215 impairs the p53/mdm2 autoregulatory loop in multiple myeloma development[J].Cancer cell,2010,18 (4)：367-381.

17 Mirabello L,Troisi RJ,Savage SA.Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004：Data from the surveillance,epidemiology,and end results program[J].Cancer,2009,115(7)：1531-1543.

（2014-02-09收稿）

（2014-04-22修回）

（本文编辑：杨红欣）

Effects of MiR-194 on the metastasis of human osteosarcoma cell line U2-OS by recombinant lentivirus vector

Kang HAN1,2,Tingbao ZHAO2,Na BIAN1,Chengkui CAI1,Shiju YAN1,Xin WANG1,Qiong MA1,Hao SHA1,Chuan DONG1, Tongtao YANG1,Yong ZHOU1,Bao'an MA1

Baoan MA;E-mail:gukemba@fmmu.edu.cn

Objective:This study aimed to construct a lentiviral expression vector for microRNA-194 and investigate its effect on the metastasis of human osteosarcoma cell line U2-OS.Methods:Pri-and mature miR-194 amplified by PCR were inserted into the plenty-GFP vector and identified by restriction endonuclease digestion and nucleotide sequencing.The osteosarcoma cell line U2-OS was transfected with the lentivirus.Then,the stable transfected cells were used in Transwell and wound healing assay.Results:Restriction analysis and sequencing showed that the recombinant lentiviral expression vector was constructed correctly.The titers of obtained overexpression and suppression expression recombinant lentivirus were 1.5*108and 4*108TU/ml.Cell metastasis ability was significantly different in different experimental groups(P＜0.01).Conclusion:The lentiviral expression vector for microRNA-194 was successfully constructed.MicroRNA-194 could influence the metastasis of the osteosarcoma cell line U2-OS;thus,it could be further explored as a potential target in osteosarcoma therapy.

osteosarcoma,microRNA-194,lentivirus,U2-OS cell line,metastasis