鸦胆子油口服乳液抑制肝癌发生的实验研究*

2014-07-02李超英陈文文王楚盈杨琳琳张大方

中国肿瘤临床 2014年12期

李超英陈文文王楚盈杨琳琳迟源张大方

李超英陈文文王楚盈杨琳琳迟源张大方

目的：探讨鸦胆子油口服乳液对二乙基亚硝胺（DEN）诱导的大鼠原发性肝癌的抑制作用。方法：将大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、鸦胆子油口服乳液组。采用自由饮水和灌胃给DEN的方法诱发大鼠肝癌模型，诱发肝癌第5周开始灌胃鸦胆子油口服液，5次/周，14周后处死大鼠，腹主动脉取血，全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、ALP、γ-GT和AFP的含量，观察大鼠肝系数、脾系数、胸腺系数、肝脏表面的癌结节数的变化，并进行影像学检查。结果：与正常对照组比较，模型对照组肝、脾指数和癌结节数明显增加，胸腺指数明显降低（P＜0.01），血清中ALT、AFP、AST、ALP、γ-GT的水平显著高于正常对照组（P＜0.01）；与模型组比较，鸦胆子油口服乳液显著降低肝癌大鼠肝指数、脾指数、癌结节数，升高胸腺指数（P＜0.01），血清中ALT、AFP、AST、ALP、γ-GT的水平得到明显改善（P＜0.01或P＜0.05）。结论：鸦胆子油口服乳液对原发性肝癌具有显著抑制作用，并且作用机制为多方面。

鸦胆子油口服乳液二乙基亚硝胺原发性肝癌抑制作用

原发性肝癌是我国目前发病率和死亡率极高的恶性肿瘤［1］。中药治疗原发性肝癌已成为常见的手段，且能够有效防治肝癌患者术后复发，具有改善中晚期肝癌患者的生存质量、延长患者生命等多方面的优势。鸦胆子油口服乳液是一种上市的新型的纯中药广谱抗癌制剂，主要用于治疗肺癌、肺癌脑转移、胃癌、肝癌等恶性肿瘤。临床上常用于介入治疗中晚期原发性肝癌［2-3］，本实验旨在研究肝炎阶段肝损伤时应用鸦胆子油口服乳液阻止肝癌发展，降低肝癌的发生率。采用二乙基亚硝胺（DEN）诱导大鼠肝癌模型，探讨鸦胆子油口服乳液对原发性肝癌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级雄性Wister大鼠45只，体重200～220 g。所有大鼠均购自吉林大学实验动物中心［合格证号：SCXK-（吉）2011-0004］。7080全自动生化分析仪（日本日立公司），TGL-18C高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），vivid7彩超仪（美国GE公司）。二乙基亚硝胺（Diethylnirtosamine，DEN），纯度99.0%（GC），浓度为0.95 g/mL，25 mL，购自TCI梯希爱化成工业发展有限公司。鸦胆子油口服乳液，通化仁民药业股份有限公司（批准文号：Z22025315）。丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、甲胎蛋白（AFP）、γ-谷胺酰转肽酶（γ-GT活性）试剂盒购自长春汇力生物有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组所有大鼠分笼饲养，每笼5只，饲养3天后，随机分组，分别为正常对照组、模型对照组、鸦胆子油口服液组。

1.2.2 模型制备正常对照组：整个过程中均饮用自来水。其余各组：用自来水配制浓度为95 μg/mL的DEN溶液，供实验组大鼠自由饮用，每天更换1次。连续饮用4周后，改饮一般的自来水4周，再继续饮含95 μg/mL的DEN溶液；大鼠饮用95 μg/mL的DEN的同时，37 mg/kg灌胃，2次/周，共14周［4-7］。诱癌造模第5周开始给予治疗药物，每周连续5天给药，持续到14周。14周末次给药后禁食不禁水12 h后，用20%的乌拉坦麻醉，腹主动脉取血。

1.2.3 血清生化指标检测取血液分离出血清，用全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、AFP的含量［8-10］。

1.2.4 脏器系数的测定解剖取出肝脏、脾脏、胸腺，用生理盐水洗净吸干后称重，计算脏器指数。即脏器指数=脏器体重（mg）/体重（g）；并记录肝表面的结节数。

1.2.5 影像学检测大鼠腹部剪毛处理，用彩超仪对大鼠肝脏进行扫描。彩超检测条件：深度5 cm，探头频率8.0 MHz。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肝脏、脾脏、胸腺系数和癌结节数的差异

与正常对照组比较，模型对照组大鼠肝脏、脾脏、胸腺系数和癌结节数均有显著性差异（P＜0.01）；与模型组比较，鸦胆子油口服乳液组肝系数、脾系数有显著性差异（P＜0.05），胸腺指数、肝癌结节数有极显著性差异（P＜0.01，表1）。

2.2 对大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、AFP的影响

与正常对照组比较，模型对照组ALT、AST、ALP、γ-GT、AFP水平显著高于正常对照组（P＜0.01）；与模型对照组比较，鸦胆子油口服乳液组ALT、AST、ALP明显低于模型组（P＜0.05），γ-GT、AFP水平与模型组比较有极显著性差异（P＜0.01，表2）。

2.3 影像学检查

模型对照组检出0.40 cm×0.35 cm的肿瘤，还有大小不一、多个结节存在，实质回声粗糙（图1，2）。鸦胆子油口服液组检出0.20 cm×0.18 cm的肿瘤，被膜较模型组光滑（图3，4）。

表1 鸦胆子油口服乳液对大鼠肝、脾、胸腺系数和癌结节数目的影响（±s，n=10）Table 1 Effects of BJOOE on the liver index,spleen index,thymus index,and number of nodules in rats

表2 鸦胆子油口服乳液对大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、AFP的影响（n=10）Table 2 Effects of BJOOE on the levels of ALT,AST,ALP,γ-GT,and AFP of serum in rats

图1 模型组大鼠肝脏Figure 1 Images of rat livers of the control group

图2 彩超示模型组大鼠肝脏Figure 2 Ultrasound images of rat livers of the model group

图3 鸦胞子油口服乳液组大鼠肝脏Figure 3 Images of rat livers of the model group

图4 彩超示鸦胞子油口服乳液组大鼠肝脏Figure 4 Rat liver's ultrasound images of treatment group

3 讨论

DEN是一种亚硝胺类化合物，具有中毒剂和致癌剂的双重作用，其靶器官主要是肝脏，应用DEN诱发的大鼠肝癌模型，其诱癌的过程与人类相似，经历肝炎→肝硬化→肝癌，对人类临床治疗将起到指导作用，也是较理想的适合影像学和分子生物学研究的动物模型［11］药物，且具有致癌率高，对肝脏致癌专一性强的特点，是实验研究中最常用的诱癌剂［12］。本实验采用自由饮用和强制灌胃的方法，能有效提高诱癌率。根据预实验结果，在造模的第4周，肝脏会出现损伤，肝边缘呈现黑色状态。第4周时肝炎出现。第12周时肝脏表面出现粟粒状结节，质地变硬，此时达到肝硬化阶段。到第14周，肝脏表面比较粗糙，遍布大小不等灰白色结节，会出现血性腹水，为肿瘤结节破裂出血所致。所以在第4周末第5周初时开始给予药物抑制肝癌形成。

原发性肝癌由于肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生癌变，又称为肝细胞癌。DEN诱发的大鼠肝癌模型多为结节型肝癌，癌结节呈球形或分叶状，灰白色质较软，散在肝脏表面。鸦胆子油口服乳液干预组癌结节数明显减少，肝表面较模型组光滑，表明鸦胆子油口服乳液可抑制肝癌的发生，减少癌结节的生成。

彩超检查是目前临床上常用的诊断方法，李超英等［13］已经对小鼠原位肝癌移植模型采用彩超技术队模型进行评价，确定彩超检查是一种无创诊断和可对原位肝癌检测的可行性检测方法。本研究从影像学上清晰可见肝脏上的肿瘤大小及数量，模型组检出率为100%。

ALT、AST、ALP存在于肝细胞内，当肝脏受到损伤时，大鼠血清中的ALT、AST、ALP的含量升高，升高程度与肝脏的损伤程度呈正比，是检测肝功能的常用指标。本实验中模型组ALT、AST、ALP的含量显著升高，表明肝损伤严重；而鸦胆子油口服乳液能显著改善肝功能。

AFP主要在胚胎的肝脏中合成，出生后血清中的AFP逐渐下降，当发生肝细胞癌时，血清中AFP的含量会急速上升，AFP在原发性肝癌诊断中起重要作用［14］。γ-GT只有胎儿及发生原发性肝癌时，才会异常升高，其他肿瘤γ-GT的含量还是正常水平［15］。AFP和γ-GT联合用于肝癌诊断，其诊断价值得到极大提升。二者联合也会相互补充，有助于临床早期诊断肝癌，提高诊断率，降低肝癌的发生率。本实验结果显示，模型组和鸦胆子油口服乳液组AFP和γ-GT均升高，高于空白对照组，但是鸦胆子油口服液组明显低于模型组，结果表明鸦胆子油口服乳液能阻断DEN对肝细胞的损伤。

另外，本实验长期给予肝癌模型大鼠鸦胆子油口服液未发现毒副作用，如恶心、呕吐、腹泻等症状；并且鸦胆子油口服液对大鼠的体重、脾系数和胸腺系数均有显著影响，其抗癌机制还与增强免疫有关。

总之，本实验对鸦胆子油口服液抗肝癌和阻止肝癌发生的作用机制进行深入研究，表明该药对原发性肝癌具有显著抑制作用，其作用机制抑制肝癌的发生、显著改善肝功能、阻断DEN对肝细胞的损伤和增强免疫功能等多方面，本实验研究也为该药临床防治肝癌提供科学依据。

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（2014-04-05收稿）

（2014-05-17修回）

（本文编辑：周晓颖）

Inhibition of primary liver cancer by oral javanica oil emulsion

Chaoying LI,Wenwen CHEN,Chuying WANG,Linlin YANG,Yuan CHI,Dafang ZHANG
Correspondence to:Dafang ZHANG;E-mail:zdf0431@126.com

Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China

This work was supported by the Jilin Provincial Science and Technology Development Projects(No.YYZX201265[Microsoft2])

Objective:This study aimed to investigate the inhibitory effects of Brucea javanica oil oral emulsion(BJOOE)on primary liver cancer induced by diethylnitrosamine(DEN).Methods:Rats were randomly divided into the control group,model group, and BJOOE group.Rats were given free access to water.DEN was administered intragastrically to induce liver cancer in rats.Five weeks later,rats were intragastrically administered with BJOOE for five times per week.The rats were killed after 14 weeks. Abdominal aortic blood samples were collected.The contents of ALT,AST,ALP,γ-GT,and AFP of serum were detected by an automatic biochemical analyzer.The liver index,spleen index,thymus index,and changes in liver cancer nodules of the surface were observed in rats.Changes in the number of liver cancer nodules of the surface were detected by imaging.Results:Compared with the control group,the liver index,spleen index,and number of nodules of the model group significantly increased,whereas the thymus index significantly decreased(P＜0.01).The levels of ALT,AFP,AST,ALP,and γ-GT of serum in the model group were significantly higher than those in the control group(P＜0.01).Compared with the model group,BJOOE significantly reduced the liver index,spleen index,and number of cancer nodules,but increased the thymus index in the liver of rats with cancer(P＜0.01).The levels of ALT,AFP, AST,ALP,and γ-GT of serum in rats with hepatic carcinoma significantly improved(P＜0.01 or P＜0.05).Conclusion:BJOOE could inhibit primary liver cancer,and the underlying mechanisms are complex.

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