原儿茶酸防护百草枯致胎鼠中脑细胞损伤实验研究

奚淑芳王群江潘智敏端礼荣

1浙江萧山医院 杭州 311202 2浙江省人民医院

3浙江中医药大学附属第一医院 4江苏大学医学院预防医学系

原儿茶酸防护百草枯致胎鼠中脑细胞损伤实验研究

奚淑芳1王群江2潘智敏3端礼荣4

1浙江萧山医院 杭州 311202 2浙江省人民医院

3浙江中医药大学附属第一医院 4江苏大学医学院预防医学系

目的观察原儿茶酸（PCA）对百草枯（PQ）所致胎鼠中脑神经细胞损伤的保护作用。方法取胚胎大鼠进行中脑神经细胞分离培养，随机分为空白对照组、阳性对照组、PQ组及PCA高、低浓度组（100μmol/L和50μmol/L），分别给予神经生长因子（NGF）、PQ和PCA进行配组干预，接种第6天除空白对照组，另四组均加入PQ终浓度为800μmol/L。接种第7天观察细胞生长状况。四唑盐（MTT）比色法检测神经细胞活性，抗酪氨酸羟化酶（TH）免疫荧光染色法测定多巴胺（DA）能神经元数量；TH免疫荧光染色比较各组阳性神经元数目及细胞核、轴突的变化情况。结果与空白对照组、阳性对照组、PCA组比较，PQ组细胞核固缩、破裂，细胞凋亡率升高；PCA高、低浓度预处理后，细胞存活率增加（P＜0.05），细胞轴突损伤减少，细胞凋亡率降低，且具有量-效关系。结论PCA对PQ诱导的中脑神经细胞凋亡具有抑制作用，该作用有浓度依赖性，提示PCA对胎鼠中脑神经细胞及DA能神经元有一定的保护作用。

胎鼠；中脑细胞损伤；原儿茶酸；百草枯；酪氨酸羟化酶

原儿茶酸（protocatechuic acid，PCA，即3，4-二羟基苯甲酸），是一种天然存在于许多果蔬中的酚酸类物质，也是许多中药的有效活性成分。近年研究发现，PCA具有抗氧化、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、介导肿瘤细胞凋亡等许多新的药理作用[1-2]，具有较强的清除超氧自由基和羟自由基能力[3]，PCA可抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡，抑制1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）介导的PC12细胞损伤[4-6]。本实验观察PCA对百草枯（paraquat，PQ）损伤后胎鼠中脑细胞及多巴胺能神经细胞的保护作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 孕15天SD大鼠15只，体质量（300±10）g；实验动物合格证号：SYXK（苏）2008-0024，由江苏大学医学院实验动物中心提供。

1.2药物及试剂 原儿茶酸：中国药品生物制品鉴定所（规格：50mg）；酪氨酸羟化酶一抗（小鼠抗大鼠）、PQ、DMEM细胞培养基：Sigma公司；神经生长因子（NGF）：Promage公司；荧光（FITC）试剂盒：武汉博士德公司；3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）：Gibco公司；多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）1：250：Sigma公司分装；HEPES缓冲溶液：Fetal Bovine Serum（FBS USA）。

1.3方 法

1.3.1胎鼠中脑神经细胞培养 取孕15天SD大鼠，均脱颈致死，75%乙醇浸泡5min，超净台内解剖，仔细剪开子宫，取出胚胎，解剖显微镜下剥出脑组织，精细解剖镊分离出中脑黑质部分，剪碎，加入0.125%胰蛋白酶（Trypsin 1:250），37℃5%CO2培养箱中温育25min，培养液中放置10min，终止胰蛋白酶作用，800rpm离心5min，吸弃上悬液，加培养液；火焰刨光的直头滴管吹打10次，静置沉淀，吸取上悬液，调整细胞浓度，按照每孔2×105、1×105细胞分种于24孔和96孔塑料培养板内，置37℃、5%CO2培养箱内培养。

1.3.2药物处理 接种的标本随机分为空白对照组、阳性对照组、PQ组和PCA高、低浓度组。接种后第3天细胞更换新鲜培养液，PCA组换液时培养液中加PCA（高浓度组终浓度为100μmol/L，低浓度组终浓度为50μmol/L），阳性对照组加入NGF（终浓度50μg/L），对照组、PQ组加入正常细胞培养液；接种第6天再换液1次，各组所加药物同上。PQ组、阳性对照组、PCA两组均加入用二甲基亚砜（DMSO，终浓度为0.1%）稀释液稀释的PQ（终浓度为800μmol/ L）。

1.3.3神经细胞活性测定 采用四唑盐（MTT）比色法。MTT粉剂溶于双蒸水，配制浓度为5mg/mL MTT溶液，置于4℃冰箱中保存备用。将细胞培养至第7天，在同一批培养于96孔的细胞中加入配制好的MTT每孔10μL，将其置于37℃的CO2培养箱中孵育4h，缓慢吸去上清后每孔加入100μL的二甲基亚砜（DMSO）作用10min，使之充分溶解。采用检测波长570nm的Bio-RAD680型酶标仪上测细胞吸光值（A值）。

1.3.4多巴胺（DA）能神经元计数 采用TH免疫荧光染色，95%酒精固定细胞20min，0.01mol/L PBS漂洗5min×3次，然后滴加抗体稀释液稀释的TH一抗（小鼠抗大鼠，1：3000稀释），置37℃湿盒中30min，0.01mol/L PBS漂洗5min×3次，除去非特异性吸附的抗体。滴加荧光标记的二抗（羊抗小鼠IgG-FITC），置37℃湿盒中30min，0.01mol/L PBS漂洗5min×3次，荧光封片剂封片，揩干玻片周围水分，荧光显微镜高倍（40×）采图观察，计数阳性细胞。

1.4统计学方法 实验数据用（） 表示，应用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析（先检验样本的方差齐性，对不满足齐性的资料进行非参数秩和检验）。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1细胞形态学观察 TH免疫荧光染色后空白对照组细胞为正常活性状态,细胞核边缘光滑完整,均匀淡染；PQ组大多数细胞体皱缩或肿胀，细胞核固缩、破裂，细胞表面不光滑，轴突呈串珠样肿胀或断裂甚至消失，轴突的数目及长度明显减少，网状交织的突起变得稀疏；PCA组和阳性对照组神经细胞胞体呈圆形、梭形或多角形，突起有延长、分支及细胞数目较PQ组多，见图1（封二）。

2.2神经细胞计数 TH免疫荧光染色后，高倍荧光显微镜下对显示阳性反应的神经细胞进行计数，各组随机选取9孔，每孔随机计算5个视野。PCA两个浓度组均可明显抑制PQ引起的中脑神经多巴胺能神经细胞存活率的降低,与PQ组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且两个浓度组间差异亦有统计学意义（P＜0.05），见表1。表明PCA可对抗PQ诱导的中脑多巴胺能神经细胞毒性，此作用可能有浓度依赖性。

2.3细胞活性检测 MTT比色试验，采用检测波长570nm，参考波长630nm。每组随机检测25孔，PCA两浓度组和阳性对照组细胞细胞吸光度值（A值）明显高于PQ组细胞（P＜0.05），且PCA组2个浓度组之间A值差异也有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组胎鼠中脑细胞A值及TH阳性细胞数比较（）

表1 各组胎鼠中脑细胞A值及TH阳性细胞数比较（）

注：与PQ组比较，*P＜0.05；与PCA低浓度组比较，△P＜0.05

?

3 讨论

原儿茶酸是一种酚酸类物质，是很多中药（如益智仁、丹参、芙蓉等）的有效活性成分，具有抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、抑菌、镇痛等多方面药理活性。研究表明，原儿茶酸还具有抗氧化[4]、促进皮质神经元存活及突起生长[7]等作用，对神经损伤具有保护作用[8]。酚酸类化合物分子中的酚羟基是优良的氢（或中子）的给予体，可以与过氧自由基、羟自由基等自由基结合，生成活性很弱的醌自由基结构，该结构不再具有夺取氢原子所需的能量，终止了自由基链式反应，从而清除自由基，起到抗氧化作用[9]。百草枯是一种除草剂，其通过增加氧化应激对细胞的损伤导致中脑多巴胺能神经细胞的变性、死亡，现已被广泛应用于帕金森病模型的制备[10]。

神经生长因子是一种能促进中枢和外周神经分化、生长和存活的活性蛋白质，它在神经细胞的发育和正常的生理功能维持中起着重要作用[11]。因此，我们选用NGF为阳性对照药物。本实验结果显示，PQ损伤后细胞生长明显抑制，细胞核固缩、破裂，轴突断裂，经过PCA和NGF处理后细胞生长状况较未处理者明显改善，轴突延长增多，细胞数目明显多于PQ组。PCA组及阳性对照组细胞活性（A值）及TH阳性细胞数均显著高于PQ组（P＜0.05）；PCA高浓度组A值及TH阳性细胞数均显著高于低浓度组，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。提示PCA可提高体外培养的胚胎大鼠中脑神经细胞的活性，并可能促进DA能神经生长，对抗其凋亡，此作用呈浓度依赖性。

［1］Guan S，Ge D，Liu TQ，et al.Protocatechuic acid promotes cell proliferation and reduces basal apoptosis in cultured neural stem cells［J］.Tox icol In Vitro，2009，23（2）：201-208.

［2］Zhang HN，An CN，Pu XP，et al.Protocatechuic acid inhibits neurotoxicity induced by MPTP in vivo［J］.Neurosci Lett，2010，474（2）：99-103.

［3］Tseng TH，Wang CJ，Kao ES，et al.Hibiscus protocatechuic acid protects against oxidative damage induced by tertbutylhydroperoxide in rat primary hepatocytes［J］.Chem.Biol Interact，1996，101（2）：137-148.

［4］Guan S，Bao YM，Jiang B，et al.Protective effect of protocatechuic acid from Alpinia oxyphylla on hydrogen peroxideinduced oxidative PC12 cell death［J］.Eur J Pharmacol，2006，538（1-3）：73-79.

［5］Guan S，Jiang B，Bao YM，et al.Protocatechuic acid suppresses MPP+-induced mitochondrial dysfunction and apoptotic cell death in PC12 cells［J］.Food Chem Toxicol，2006，44（10）：1659-1666.

［6］An LJ，Guan S，Shi GF，et al.Protocatechuic acid from Alpinia oxyphylla against MPP+-induced neurotoxicity in PC12 cells［J］.Food Chem Toxicol，2006，44（3）：436-443.

［7］薛小燕，罗焕敏.原儿茶酸通过A2a受体促进皮质神经元存活及突起生长［J］.中国药理学与毒理学杂志，2011，25（增刊）：13.

［8］Liu YM，Jiang B，Bao YM，et al.Protocatechuic acid inhibits apoptosis by mitochondrial dysfunction in rotenone-induced PC12 cells［J］.Toxicol In Vitro，2008，22（2）：430-437.

［9］聂波，黄锋，刘勇，等.中药中的四个酚酸化合物的抗氧化活性研究［G］.第八届全国中西医结合实验医学研讨会论文汇编.2006.

［10］张闿艺，黄小军，黄晓峰.帕金森病环境毒素模型的研究进展［J］.医学综述，2008，14（21）：3272-3275.

［11］倪厚杰，唐洲平.神经生长因子治疗脑出血的作用机制［J］.卒中与神经疾病，2012，19（1）：58-61.

修回日期：2013-12-10

Protective Effect of Protocatechuic Acid on Paraquat-induced Mesencephalic Cell Damage in Fetal Rats

XI Shufang1,WANG Qunjiang2,PAN Zhimin3,DUAN Lirong4.1 Zhejiang Xiaoshan Hospital of Zhejiang,Hangzhou (311202),China;2 Zhejiang Provincial People's Hospital;3 First Hospital Affiliated to Zhejiang Traditional Medical University;4 Department of Preventive Medicine,College of medicine,Jiangsu University.

ObjectiveTo investigate the protective effect of protocatechuic acid（PCA）on paraquat（PQ）-induced midbrain neural stem cell injuries of fetal rats.MethodsThe midbrain neural stem cells of fetal rats were isolated and cultured,and then the cells were divided into control group,positive control group,PQ group,and PCA groups（100 and 50μmol/L）.On day 3,the cells were treated with nerve growth factor（NGF）,PQ and PCA to observe the growth status of cells.On day 6,except for control group,the cells in other 4 groups were treated with PQ of 800 μmol/L.MTT assay was used to detect neural cell activity and the number of dopaminergic（DA）neurons was determined with antibodies of tyrosine hydroxylase（TH）by immunofluorescence.The neural cellular morphology, counts,and axons were compared among different groups.ResultsCompared with control group,positive control group,and PCA groups,cell survival was decreased,and cell chromatin pyknosis and apoptosis was increased in PQ group（P＜0.05）;After treatment with two doses of PCA,cell survival was increased（P＜0.05）and cell axonal injury was reduced and apoptosis was decreased in a dose-effect manner.ConclusionPCA has an inhibitory effect on apoptosis of embryonic rat mesencephalic cells induced by PQ,and this effect is concentration dependent. This indicated that Tip PCA had a protective effect on primary cultured mesencephalic cells and DA neurons.

fetal rats；mesencephalic cell damage；protocatechuic acid；paraquat；tyrosine hydroxylase

2013-10-26