花椒多酚类化合物对脑卒中后抑郁大鼠脑组织NE、5-HT及MAO的影响

竺平晖 浙江省舟山市普陀区人民医院药剂科 舟山 316100

花椒多酚类化合物对脑卒中后抑郁大鼠脑组织NE、5-HT及MAO的影响

竺平晖 浙江省舟山市普陀区人民医院药剂科 舟山 316100

目的探讨花椒多酚类化合物总提取物（ZPPC）抗脑卒中后抑郁作用机制。方法建立脑卒中后抑郁大鼠模型，酶联免疫法检测ZPPC、氟西汀对受试大鼠脑组织去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）含量的影响；采用荧光分光光度法测定ZPPC和吗氯贝胺对受试大鼠脑内单胺氧化酶（MAO）活性的影响。结果与空白对照组比较，模型组NE、5-HT水平显著降低（P＜0.05），ZPPC高剂量组（200mg/kg）和氟西汀组与模型组比较，NE、5-HT水平均有显著性升高（P＜0.05）；ZPPC中、高剂量组（100mg/kg和200mg/kg）还明显抑制大鼠脑组织MAO-A活性（P＜0.05）。结论ZPPC组能显著提高脑卒中后抑郁大鼠脑组织NE、5-HT水平，其作用机制可能与抑制脑组织MAO-A活性有关。

大鼠；脑卒中后抑郁；花椒多酚类化合物；NE；5-HT；MAO

脑卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是脑卒中后常见的并发症，临床发病率为20%～50%。抑郁症可影响患者原发疾病的康复和转归，并增加脑血管病患者的病死率[1]。PSD的病因非常复杂，实验研究发现，PSD的发生与神经生物学有关，即脑内单胺类神经递质的代谢紊乱。目前的研究集中在5-羟色胺能神经传递通路的改变上，研究发现，患者外周血去甲肾上腺素（NE）和5-羟色胺（5-HT）含量减少[2]，这可能是PSD发病的病理生理基础。花椒为芸香科植物青椒Zanthoxylum schinifolium Sieb.Et Zucc.或花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.的干燥成熟果皮，味辛，性温，小毒，具有“温中止痛，驱虫，外用燥湿，杀虫止痒”的功效[3]，其主要化学成分有生物碱、酰胺、木脂素、香豆素、挥发油和脂肪酸等。研究表明[4]，花椒多酚类化合物总提取物（ZPPC）急性给药在小鼠行为绝望模型中显示出明显的抗抑郁作用。本研究通过建立卒中后抑郁动物模型，采用酶联免疫法观察ZPPC对模型大鼠脑组织NE、5-HT水平的影响，荧光分光光度法测定ZPPC对受试大鼠脑内单胺氧化酶（MAO）活性的影响，从而为临床预防脑卒中后抑郁提供实验依据。

1 实验材料

1.1动 物 雄性SD大鼠105只，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号SCXK（沪）2012-0002，二级，体质量＞250g。每笼5只，室温（23±1）℃，湿度（50±10）%，自然光照，自由摄食饮水。

1.2药品与试剂 花椒自备。粉碎，丙酮-水溶液（7：3）浸提，减压除去浸提液中丙酮，然后过滤残留水液，将滤液经醋酸乙酯萃取分离，脱水干燥，得到花椒多酚类化合物总粗提取物（ZPPC），得率为0.033%。ZPPC为黄棕色粉末，实验前用双蒸水配成所需浓度。氟西汀：美国礼来公司。二氢溴犬脲胺、4-氢喹啉、司立吉林、氯吉林、吗氯贝胺均购自中国药品生物制品鉴定所。抗感染药：青霉素。5-HT试剂盒：上海达豪生物科技有限公司。NE试剂盒：上海富众生物科技发展有限公司。甲醛（分析级）、乙醚（分析纯）、冰乙酸：无锡市晶科化工有限公司。

1.3仪 器 DZKW电热恒温水浴锅：天津市精科材料试验机厂。FSH-Ⅱ高速电动匀浆器：江苏金坛实验仪器厂。BIO-RAD550全自动酶标仪：美国伯乐。BS110S分析天平：北京塞多斯仪器公司。TGL-16GA冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂。R-5000荧光分光光度计：日本岛津公司。

2 实验方法

2.1动物分组 105只健康SD大鼠，随机分为：①双侧颈总动脉结扎、行为限制+ZPPC高、中、低组（ZPPC组）；②双侧颈总动脉结扎、行为限制+氟西汀组（氟西汀组）；③吗氯贝胺（吗氯贝胺组，单胺氧化酶活性测试）；④单纯双侧颈总动脉结扎、行为限制组（模型组）；⑤假手术组（空白对照组）。

2.2模型制备 脑卒中模型参照刘汇波等[5]造模法制备。脑卒中后抑郁大鼠模型的制备[6]：将成功达到脑缺血模型的大鼠，连续7天，每天10：00～16：00任取时间限制在特制的观察笼中，予以2h的行为限制。如大鼠表现为运动活动性明显降低、兴趣缺乏、进取性降低、易绝望等特点则为造模成功。

2.3给药方法 模型制备成功后开始给药，按照正常成人和大鼠每千克体质量等效剂量换算系数，计算ZPPC高中低组每天给药剂量相当于含花椒多酚类化合物总提取物药量分别为200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg，制为药液1.5mL灌胃，1天1次，给药3周。氟西汀组给予氟西汀胶囊水溶液灌胃，按2.06mg/（kg·d）给药，1天1次，给药3周。吗氯贝胺组测试前60min按20mg/kg灌胃给药；模型组及假手术组予生理盐水1.5mL灌胃，1天1次，给药3周。

2.4NE、5-HT含量测定 各组于3周后处死大鼠，取出脑海马区部分组织，称重后置入1mL玻璃组织匀浆器中，加入预冷的0.1%高氯酸400mL，冰浴上下转动8min，充分研磨使组织匀浆化后，将组织匀浆液倒入离心管内，置离心机内以（4℃）10 000×g离心15min，吸取上清液，用0.1%高氯酸溶液定容至0.5mL。大鼠脑组织中NE、5-HT的含量测定按照试剂盒说明书进行。

2.5单胺氧化酶活性测定[7]分离出部分脑组织，称重后加入4mL冰冷磷酸缓冲液（pH7.8，0.05mol/L）制成匀浆液，在2.5mL磷酸缓冲液中加入20%曲通0.4mL和组织匀浆液0.2mL，溶液混合后38℃预孵育10min，在反应液中加入30μL 2.19mmol/L底物，37℃孵育30min，反应液中加入0.2mL高氯酸溶液（5mol/ L）中止反应，冷却并离心10min；取0.5mL上清液，加入1mol/L氢氧化钠溶液2.5mL。通过荧光分光光度计在激发光318nm、发射光380nm处测定产物4-氢喹啉的荧光强度。单胺氧化酶活性以nmol/30min/mg protein表示。采用Bradford法[8]测定蛋白含量。

2.6统计学方法 应用SPSS16.0软件，计量资料以（） 表示，进行单因素方差分析（One-way ANOVA），组间差异采用Dunnrtt’s t-test。

3 实验结果

3.1各组大鼠脑组织NE、5-HT含量比较 与空白对照组比较，模型组NE、5-HT水平显著降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，ZPPC低、中、高组NE、5-HT水平上升趋势明显，其中ZPPC高剂量组NE、5-HT与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），此结果与阳性对照药组氟西汀组的结果趋于一致。见表1。

表1 各组大鼠脑组织NE、5-HT含量比较（） ng/mL

表1 各组大鼠脑组织NE、5-HT含量比较（） ng/mL

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

3.2各组大鼠脑组织MAO活性比较 与空白对照组比较，模型组大鼠MAO-A活性有升高趋势，而MAO-B活性有一定的抑制，但差异均无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，ZPPC低、中、高剂量组大鼠MAO-A活性显示出梯度抑制，且ZPPC中（100mg/kg）、高（200mg/kg）剂量组MAO-A活性抑制差异有统计学意义（P＜0.05）；ZPPC各剂量组对MAOB的活性无明显影响（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠脑组织MAO活性比较（）nmol/30min/mg protein

表2 各组大鼠脑组织MAO活性比较（）nmol/30min/mg protein

注：与模型组比较，△P＜0.05；与ZPPC中剂量组比较，*P＜0.05

组别空白对照组模型组ZPPC低剂量组ZPPC中剂量组ZPPC高剂量组吗氯贝胺组剂量/（mg/kg）00 50.00 100.00 200.00 20.00 n/只15 15 15 15 15 15 MAO-A 65.2±3.3 69.3±3.0 60.8±3.6 42.6±3.3△29.5±2.5△* 22.1±1.5△MAO-B 162.5±6.2 159.6±7.3 160.7±8.5 162.6±6.7 158.6±7.7 160.5±8.3

4 讨论

目前认为PSD的发病机制主要有两种，一种是生物学机制，认为卒中直接损伤了与情绪有关的神经环路，影响5-羟色胺能和去甲肾上腺素能神经元及其通路，导致两种递质水平降低而引起抑郁[9]；另一种是社会心理学机制，认为卒中后的心理应激障碍是PSD的主要原因。研究表明[10-11]，单胺能递质环路在抑郁的发病中发挥重要作用。本研究亦发现模型组大鼠NE和5-HT含量均低于空白对照组（P＜0.05），表明卒中后抑郁模型大鼠脑组织NE和5-HT含量水平降低。而ZPPC高剂量组（200mg/kg）和氟西汀组可明显提高模型大鼠脑组织NE和5-HT含量水平，表明ZPPC对卒中后抑郁大鼠脑内单胺递质降低有改善作用，这可能是其治疗PSD的机制之一。

有研究表明[12]，单胺氧化酶抑制剂可引起单胺类神经递质在神经末梢的储存和释放增加，从而提高单胺能神经的活性，改善情绪。单胺氧化酶根据底物的特异性和对抑制剂的敏感性分为A、B两类。MAO-A被低浓度的氯吉林抑制，主要氧化NE和5-HT；而MAO-B的特异性底物为苯乙胺，选择性的酶抑制剂为司来吉林，主要影响脑内多巴胺（DA）的代谢。吗氯贝胺作为选择性单胺氧化酶抑制剂的代表药，可选择性作用于MAO-A，而对MAO-B型作用短暂而轻微。实验结果显示，与模型组比较，脑卒中后抑郁大鼠在给予ZPPC低、中、高剂量处理后，MAO-A活性显示出梯度抑制，且在ZPPC100mg/kg和200mg/kg剂量组MAO-A活性抑制差异有统计学意义（P＜0.05），这也验证了ZPPC急性给药结果[4]。ZPPC在行为绝望模型中呈现出明显的抗抑郁作用，其作用机制可能通过抑制脑内单胺氧化酶活性有关。而ZPPC各剂量组对MAO-B的活性无明显影响（P＞0.05），这可能与ZPPC特异性作用于MAO-A有关，其确切的抗卒中后抑郁机制需进一步研究。

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Influence of Polyphenol Extract from Zanthoxylum Bungeanum Maxim.on Norepinephrine,5-hydroxytryptamine and Monoamine Oxidase in Brain Tissue of Rats With Post-Stroke Depression

ZHU Pinghui. Department of Pharmacy,Zhoushan Putuo People's Hospital,Zhoushan(316100),China

ObjectiveTo explore the mechanism of polyphenol extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim.（ZPPC）on treating post-stroke depression.MethodsPost-stroke depression model of rat was established.ELISA was used to detect the influence of ZPPC and fluoxetine on norepinephrine（NE）and 5-hydroxytryptamine（5-HT）contents in brain tissue and the monoamine oxidase（MAO）activity in rats brain was determined by fluorescence spectrophotometry.ResultsThe levels of NE and 5-HT in brain tissue was significantly lower in model group as compared with control group（P＜0.05）,but dramatically elevated after treatment with high-dose ZPPC（200mg/kg）and fluoxetine（P＜0.05）.The activity of MAO in rats brain was inhibited by intervention of ZPPC with 100 and 200 mg/kg as compared with model group（P＜0.05）.ConclusionZPPC can upregulate NE and 5-HT in brain tissue of rats with post-stroke depression and the underlying mechanism may involve inhibition of MAO activity.

rats；post-stroke depression；polyphenols extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim；norepinephrine；5-hydroxytryptamine；monoamine oxidase

2013-10-22