氟喹诺酮类残留检测方法的研究进展

王晶晶 许常旭 黄华国 陆志波

（1.宁波出入境检验检疫局 浙江宁波 315012；2.中国药科大学；3.洞头县产品质量监督检验所；4.同济大学环境科学与工程学院）

氟喹诺酮类残留检测方法的研究进展

王晶晶1,4许常旭2黄华国3陆志波4

（1.宁波出入境检验检疫局 浙江宁波 315012；2.中国药科大学；3.洞头县产品质量监督检验所；4.同济大学环境科学与工程学院）

氟喹诺酮类药物作为广谱高效抗菌药物，在国内外畜牧业和养殖业中得到广泛应用，但其残留超标会危害人体健康, 此问题越来越被人们重视。本文就氟喹诺酮类药物的特性以及4大类残留检测方法进行了综述。

氟喹诺酮类药物；特性；残留检测

1 前言

氟喹诺酮（Fluoroquinolones，FQs）又称新喹诺酮，是一系列新型6-氟取代的喹诺酮类(Quinolone，QNs)衍生物，具有吸收性好，抗菌谱广，抗菌作用强，半衰期长，血药浓度高，化学合成简便，价格低廉等优点，是人医和兽医的常用药。随着FQs类药物在畜牧业和养殖业中的广泛应用，常伴有滥用药情况出现，不但提高了致病菌的耐药性，也增加了某些FQs类药物的潜在致癌性等风险，因此，其残留问题已引起了人们高度重视。本文综述了动物性食品中FQs类药物特性及其残留检测方法。

2 FQs类药物特性

自1979年发现诺氟沙星(Norfloxacin)以来，FQs类抗菌药凭借其优异的抗感染作用，得到快速发展。目前世界上已有15个FQs类药物上市，还有近50种正在开发中，其中甲磺酸达氟沙星、盐酸二氟沙星、恩诺沙星、盐酸沙拉沙星为兽类专用药。

2.1 FQs类药物的构效关系

FQs类药物的基本结构通式见图1，因在喹诺酮萘啶环 6 位F的引入而得名为氟喹诺酮。F的引入提高了化合物的脂溶性，增强了对组织细胞的渗透性，因而吸收好，组织浓度高，更显著增强化合物抗G-致病菌的效力和扩大抗G+菌谱；1 位通常连接一个烃基(如乙基或环丙基)，可影响抗菌活性和抗菌谱；3位的羧基和4的位羰基为抗菌活性必需，可以与受体酶蛋白形成离子键和氢键；8位杂环 X 可以是C、N或 O原子，母核上 2、5、7位的修饰可以改变化合物药动学特性。

图1 FQs类药物的结构通式

2.2 FQs类药物的作用机制及耐药机制

FQs类药物通过选择性与G-菌DNA双链中非配对碱基结合，抑制DNA 螺旋酶的A亚单位，使DNA超螺旋结构不能封口，不能形成负超螺旋结构，同时又可选择性抑制G+菌拓扑异构酶Ⅳ，从而影响 DNA 的正常形态与功能，阻碍 DNA的正常复制、转录、转运与重组，从而导致细菌死亡。

近年来，随着FQs类药物在临床和畜牧养殖业的滥用，导致细菌耐药率上升，耐药菌株增多。FQs耐药菌的来源通常有医源性、动物源性、食源性，耐药机制主要有：①DNA螺旋酶亚基A或拓扑异构酶变异；②耐药性质粒出现；③细菌细胞膜通透性下降、药物主动外排以及细菌生物被膜产生导致细胞内药物浓度减少。细菌耐药通常多机制连同作用，同时FQs类药物作用机制大多相同，故常出现交叉耐药性。

2.3 FQs类药物残留及危害

随着畜牧业快速发展，FQs类药物在治疗和预防动物疾病、促进动物生长、提高饲料转化率上得到广泛应用，导致FQs类药物的原形及其代谢产物可蓄积或贮存于动物的细胞、组织、器官或可食性产品（如蛋、奶等）中，形成了药物残留。这些动物性食品中的药物残留将随着食物链进入人体，对人类的健康构成潜在威胁，如皮疹、过敏性休克等不良反应，并会抑制人体肠道中正常的敏感菌群生长以及导致致病菌产生耐药性，同时还可能存在致癌性。

因此，联合国粮农组织、世界卫生组织、欧盟、日本等都将FQs类药物列入限制使用的兽药名单，并已制定出相应的最高残留量(MRLs)，我国也于2002年规定了兽用FQs类药物的MRLs，见表1。

表1 我国农业部235号公告规定兽用氟喹诺酮类药物的MRLs

（续表）

3 FQs类药物残留的检测方法

目前国内外用于检测FQs类药物残留的方法主要有微生物检测法、色谱仪器分析法、免疫分析法和化学发光与电化学发光分析法。

3.1 微生物检测法

微生物检测法是应用最早的方法，适用于对畜禽组织中的抗菌药物进行筛选检验。其检测原理是基于FQs类药物对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，可定性或定量确定样品中FQs类药物的残留。微生物检测法具有相关性好、检测药物广泛、预处理简单、成本低廉和适用大量样品筛选等优点，但存在检出限过高、灵敏度较低、特异性不强、耗时较长等不足。1998年，Okernman等[1]利用改良的欧洲四平皿法检测市售肉品中的恩诺沙星和环丙沙星残留。在国内，黄晓蓉等[2]采用E.coliATCC8739为检测菌建立检测鳗鱼及其制品中FQs药物残留的微生物法，发现环丙沙星、恩诺沙星、其他喹诺酮类药物的检测限分别为20μg/kg、25μg/kg、50-250μg/kg，其中恩诺沙星的回收率为75.89％-83.12％。陈曦等[3]以金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌5种菌为工作菌，建立了3种FQs类药物(恩诺沙星、环丙沙星和左氧氟沙星)残留的微生物检测法，并利用利血平对3种药物的增敏作用，有效地增加FQs类药物的检出率，提高微生物检测法的灵敏度。最近报道，Orlando Nagel等采用3种抗生素高敏感型细菌（嗜热脂肪肚芽胞杆菌、蜡样芽孢杆菌和枯草杆菌），以半定量微滴板法准确区分牛奶中喹诺酮类、四环素类、β-内酰胺类和磺胺类4大类抗生素残留，该法的亮点是将传统MPMS耗时24h缩短到6h，实用性更强[4]。

3.2 色谱仪器分析检测法

3.2.1 高效液相色谱法（HPLC）

HPLC是在经典液相色谱法基础上发展而来，通过高分离效能的色谱柱和高灵敏度的紫外线、荧光或二极管阵列检测器达到分离、检测FQs类药物残留目的。HPLC是目前最常用的检测方法，具有分离度好、准确性高、专属性强和操作自动化高等优点，但也存在溶剂消耗量大、仪器价格高、前处理复杂等缺点。叶鹿鸣等[5]采用HPLC法检测牛奶中环丙沙星、双氟沙星和沙拉沙星3 种FQs残留，将样品经磷酸盐缓冲液稀释、超声提取，用Waters Oasis®HLB固相萃取小柱进行浓缩、净化，供HPLC分析；流动相为甲醇-乙腈-12％甲酸(15：15：70)；激发波长275nm，发射波长445nm；在0.1-5.0mg/L范围内3种FQs关系线性良好，回收率在90.0％-102.0％之间，相对标准偏差为4.1％ -10.0％，检出限分别为0.02 mg/L、0.015 mg/L和0.02 mg/L。胡煜等[6]采用基质固相分散法结合HPLC-DAD检测猪肉组织中的依诺沙星和洛美沙星残留，在0.1-1.0μg/L范围内，2种FQs关系线性良好，回收率在80.6％-99.2％之间，相对标准偏差低于6.1％，检出限分别为7μg/ kg-34 μg/kg。该方法同时还检测出2种磺胺类药(对氨基苯磺酰胺、新诺明)和1种四环素(四环霉素)。

3.2.2 液相色谱-质谱联用法(LC-MS)

随着质谱（MS）的发展和普及，利用LC-MS 和LC-MS/MS等技术可以得到特异性更强、灵敏度极高和分析范围更广的结果。因此，2008年LC-MS被列为水产品中15种FQs类药物残留检测的国家标准。焦豪妍等[7]建立固相萃取- HPLCMS/MS法测定牛奶中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星和芦氟沙星残留量；牛奶样品经乙酸酸化、乙腈沉淀蛋白质后，过C18固相萃取小柱净化，在氮气下浓缩干燥，以甲醇-10mmol/L醋酸铵水溶液(25：75)为流动相溶解残渣，涡旋后转移上清液供 HPLC-MS/MS分析测定；结果表明5种药物在0.5-200ng/g浓度范围内色谱响应线性关系良好(r＞0.99)，最低响应值为0.5ng/g。Yu等[8]利用快速溶剂萃取结合HPLC-MS/MS法同时测定了不同动物性食品中15种FQs类药物，将样品经乙腈提取，用Waters Oasis®HLB固相萃取小柱进行净化，供 HPLC-MS-MS分析，在10-800μg/ kg范围内15种FQs关系线性良好，回收率在70.6％-111.1％之间，相对标准偏差小于15％。

3.2.3 高效薄层色谱法( HPTLC)

HPTLC是将HPLC结合经典的薄层色谱法。在药物残留分析上，因其分离分析速度快，对样品预处理要求低，操作简单，适合样品的高通量筛选分析。Shital等[9]建立一种测定血浆中氧氟沙星的HPTLC确证分析方法，样品经三氯乙酸沉淀，用毛细管Linomat IV自动进样器取上清液于F254硅胶板，以正丁醇-甲醇-氨水(6：1：3)为展开剂，295nm下紫外检测，线性回归率在88.10％左右。

3.2.4 高效毛细管电泳法(HPCE)

HPCE是近年发展起来的新技术，与HPLC法相比，它不受运行缓冲液的酸、碱性和其中表面活性剂等添加剂的影响，具有样品用量少、分析速度快、分离效率高、运行成本低、适用范围广等特点，有利于实际样品的分析。Yang等[10]利用区带毛细管电泳法结合非接触式电导耦合检测技术对酸性缓冲液中的芦氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、加替沙星和莫西沙星5种FQs药物进行了分析，迁移时间和峰面积的日内RSD分别为0.65％和12.3％，日间RSD分别为 1.28％和 8.8％，最低响应值为6.8-11.7ng/g。研究表明该方法适用于复杂基质内FQs药物的快速检测。

3.3 免疫分析检测法(ELISA)

ELISA是以抗原或半抗原和抗体特异性结合为抗原-抗体复合物的免疫反应为基础的生化测试技术，目前主要有间接竞争 ELISA 法、在线免疫亲和色谱法和免疫传感器法3种。Gobbo等[11]用环丙沙星与牛血清蛋白偶连，4次免疫新西兰雌性家兔，从家兔耳边缘静脉取血，离心提取血清，经PTA-ELISA方法测定，用碱性磷酸(酯)酶和辣根过氧化物酶显色，所得数据用Packard系统软件统计，能有效检测家畜体内环丙沙星残留量。用此方法还可检测其他的FQs类兽药，如诺氟沙星、恩诺沙星、氧氟沙星。

3.4 化学发光(CL)与电化学发光(ECL)检测法

CL是借助FQs类药物分子吸收化学反应释放的能量发生能级跃迁，在电子回到基态中产生光辐射来进行定性定量分析的方法。该法反应装置简单，检测灵敏度高，光学系统简单，背景信号干扰小，适用于复杂样品的定性定量分析。常见的CL有敏化化学发光法、紫外分光光度法和荧光法等。如冯仕云等[12]采用荧光法结合化学计量学(主成分分析、偏最小二乘法和偏最小二乘判别)来建立牛奶中单诺沙星残留的快速检测定性定量模型，定性模型可以准确区分样品阴性与阳性，定量模型预测回收率在91％-110％，预测误差在可接受范围；同时该方法的检出限为0.246μg/L，定性检测的灵敏度达到100％。ECL是将CL与电化学技术相结合的一种新的分析方法，对比CL具有更好的选择性。常见的ECL有胶束电动毛细管电泳法、示波极谱法和吸附溶出伏安法等。

4 结语

由于在兽医临床和水产养殖中的广泛应用以及其残留问题，FQs类药物残留检测技术越来越受到研究工作者的重视。比较FQs类药物4种主要检测方法，其中微生物检测法预处理简单、成本低廉，但存在检测限过高、特异性不强，主要适用大量样品初次筛选；色谱仪器分析法以其高效、快速、灵敏、准确等优点成为当前检测的主流方法，但同时也有预处理复杂，仪器价格昂贵，不适宜大规模普及；CL和ECL法原理复杂，数据分析繁琐，实用性不强；ELISA法具有灵敏度高、特异性强、处理简便等优点，并且随着生物技术的高速发展，专一性单抗和多残留检测试剂盒的出现，在不久ELISA法必将取代色谱检测法成为FQs类药物最常用检测法。

［1］Okerman L, Hoof J V, Debeuckelaere W. Evaluation of the European Four-plate Test as a tool for screening antibiotic residues in meat samples from retail outlets[J]. AOAC Int, 1998, 81(1)：51-56.

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Progress in Fluoroquinolones Residue Detection Methods

Wang Jingjing1,4, Xu Changxu2, Huang Huaguo3, Lu Zhibo4
1.Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Ningbo, Zhejiang, 315012; 2.China Pharmaceutical University; 3.Dongtou Product Quality Supervision and Inspection; 4.College of Environmental Science and Engineering, Tongji University)

As a broad-spectrum antimicrobial drug, fl uoroquinolone has been widely used in animal husbandry and aquaculture industry at home and abroad. However, its standard-exceeded residues harmful to human health hazard exists, and this problem has aroused more and more attention. In this paper, the characteristics of fl uoroquinolones residue detection methods and it’s four categories were reviewed.

Fluoroquinolones; Characteristics; Residues

S859.83