RP—HPLC法测定阿魏酸衍生物的含量及其有关物质

陈丽芳等

[摘 要] 目的：建立测定阿魏酸衍生物（BL）含量及其有关物质的高效液相色谱法。方法：采用Agilent Eclipse C18（250mm×4.6mm，5?m）色谱柱，流动相为甲醇-0.1%乙酸（42：58），流速1.0 mL·min-1；检测波长228nm；进样量20?L；柱温：40℃。结果：在该条件下BL主峰与有关物质得到很好的分离；检测浓度在0.08～0.32mg·mL-1范围内具有良好的线性关系（r=0.9996）；检测限和定量限分别为8ng和36ng。结论：该方法准确可靠，灵敏度高，专属性好，可用于BL含量及其有关物质的测定。

[关键词] 反相高效液相色谱法；阿魏酸衍生物；含量测定；有关物质

中图分类号：O657 R284.1 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2014）03-072-03

[Abstract] Objective： To establish an RP-HPLC method for determination of the content of ferulic acid derivative （BL） and its related substances. Methods： Agilent Eclipse C18（250mm×4.6mm，5?m） column was adopted；the mobile phase consisted of methanol-0.1% acetic acid （42：58） at the flow rate of 1.0 mL·min-1；The ultraviolet detection wavelength was set at 228nm；Loaded volume was 20?L；the column temperature was 40℃. Results： Using this method，BL and its related substances were well separated；The standard curve was rectilinear in the range of 0.08mg·mL-1～0.32 mg·mL-1 （ r=0.9996） ；The limit of detection and quantification were 8ng and 36ng. Conclusion： The method appeared to be accurate， reliable， sensitive， specific and can be used for the determination of the content BL and its related substances.

[Key words] RP-HPLC；ferulic acid derivative；assay；related substances

阿魏酸衍生物（BL）是对阿魏酸（Ferulic Acid，4-羟基-3-甲氧基肉桂酸）苯环进行改造后的化合物，是一个良好的抗氧化剂[1]。文献[2]报道其清除自由基的能力比阿魏酸明显增强。BL结构中溴原子的引入[2]，不仅提高了清除自由基的能力，还明显增大了脂溶性，这有利于其在生物体内的转运与吸收。本文参照文献[3-6]建立了反相高效液相色谱方法，用于测定BL含量及其有关物质，为其质量的可控奠定基础。

1 仪器与试剂

Waters 600-717-996高效液相色谱仪（二元泵，二极管阵列检测器，自动进样器，Millennium32色谱工作站）；电子分析天平（Sartorius，BP211D）；KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；甲醇（色谱纯，禹王试剂）；乙酸（分析纯，国药集团）；水（娃哈哈纯净水）；30%H2O2（分析纯，国药集团）；盐酸（分析纯，国药集团）；氢氧化钠（纯度：96.0%，西陇化工有限公司）；BL对照品（批号：20121101纯度：99.91%，由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供）；BL供试品（由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供，批号分别为20130201，20130202，20130203）。

2 色谱条件与系统适用性试验

采用Agilent Eclipse C18（250mm×4.6mm，5?m）色谱柱；流动相：甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V）；紫外检测器检测波长228nm；流速1.0mL·min-1；进样量20?L；柱温：40℃。理论塔板数以BL计算不低于5000，分离度大于1.5，色谱图见图1（主峰保留时间：14.5min，杂质1保留时间：5.8min，杂质2保留时间：12.8min，杂质3保留时间：38.8min）。

3 溶液的配制

3.1 对照品溶液

取BL对照品约10mg，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

3.2 供试品溶液

取BL供试品约10mg，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

4 方法专属性考察

分别精密称取BL供试品约20mg，置3个25mL棕色量瓶中，加甲醇适量，超声助溶，进行如下破坏试验：①酸破坏：加1mol·L-1盐酸1mL，室温下静置17h，用1mol·L-1氢氧化钠中和，加甲醇稀释至刻度，摇匀；②碱破坏：加1mol·L-1氢氧化钠4mL，室温下静置65h，85℃水浴2.5h，冷却至室温，用1mol·L-1盐酸中和，加甲醇稀释至刻度，摇匀；③氧化破坏：加30%双氧水8mL，室温下静置62h，85℃水浴2.5h，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀。endprint

按照“2”项下的色谱条件，分别取各破坏溶液20?L进样，记录色谱图，见图2。 通过破坏试验可以看出BL 在碱、氧化条件下比较稳定，放置期间有关物质略有增加，在酸性条件下极不稳定，有关物质增加明显，但有关物质均与主峰分离良好，不干扰样品测定，说明该方法专属性好。

5 方法学考察

5.1 线性关系考察

精密称取BL对照品（批号：20121101）约4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分别置于50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶并稀释成约0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度对照品溶液。分别取上述溶液20?L进样测定，记录色谱图。以峰面积A对浓度C（mg·mL-1）进行线性回归，得回归方程 A=84486C-327332（r = 0.9996），表明BL在0.08～0.32mg·mL-1浓度范围内呈良好线性关系。

5.2 仪器精密度试验

取浓度为0.20mg/mL对照品溶液，连续进样6次，每次20?L，以峰面积计算，所得RSD为0.57%（n=6），表明测定时的仪器精密度良好。

5.3 重复性试验

取同一批号的BL供试品按“3.2”项下方法操作，配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3个浓度的标准溶液，每个浓度平行配制3份，共9份，照“2”项下色谱条件测定，按外标法以峰面积计算样品含量，测得平均含量为100.35%，RSD为0.50%（n=9），表明方法重复性良好。

5.4 稳定性试验

取室温下放置的低、中、高3个浓度的供试品溶液，各取20?L在0，4，6，8，10，12h的条件下，按照“2”项下色谱条件测定峰面积，测得RSD分别为1.7%、1.4%、1.3%，表明供试品溶液在12h内稳定。

5.5 检测限与定量限

精密吸取“3.1”项下对照品溶液，加甲醇逐级稀释，进样，记录色谱图，在信噪比（S/N）为3：1时测得检测限为8ng，在信噪比（S/N）为10：1时测得的定量限为36ng。

6 样品含量测定

按“3”项下的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液，各取20?L进样，按外标法以峰面积计算样品含量，结果表明，3批样品含量均在99.0%以上（见表1）。

7 有关物质测定

取BL供试品约20mg，精密称定，置25mL棕色量瓶中，加甲醇适量，超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得0.80mg/mL的溶液作为供试品溶液。精密移取此溶液适量，用甲醇稀释100倍，得自身对照溶液。以不加校正因子主成分自身对照法计算有关物质的含量[7]。结果表明，有关物质均在1%以内（见表1）。

8 讨论

8.1 波长的选择

取BL对照品溶液进行紫外扫描显示其最大吸收波长在228nm和317nm处，其中228nm处的吸收值最高，因此选择228nm用于BL的含量测定，保证测定时有较高的灵敏度。

8.2 柱温的选择

考察了25℃、30℃、40℃的不同柱温下对样品分离效果的影响，实验表明，采用40℃的柱温，可减小流动相粘度、降低柱压、缩短出峰时间并改善分离效果，故将柱温定为40℃。

8.3 流动相的选择

根据BL的化学性质，考虑采用酸性流动相可以获得较好效果。经过实验比较采用甲醇-乙酸-水系统作为流动相，并且变换流动相比例和乙酸浓度，最终确定流动相为甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V），此条件下分离效果最好，保留时间适中。

8.4 稳定性考察

由于BL的结构特性，通常在溶液中不稳定，且见光易分解[8-9]，考察了BL溶液在透明量瓶和棕色量瓶中的稳定性，发现BL溶液在透明量瓶放置8小时后含量显著降低，而在棕色量瓶中的放置12小时含量变化不大，RSD小于2.0%，但是随着时间增长含量仍会缓慢降低。故在试验过程中需采取避光措施，并于配制后尽快使用。

8.5 结论

综上所述，本方法操作简便且检测限、定量限、精密度、重复性等均符合要求，故本法适用于对BL含量及其有关物质进行测定，对于BL的质量控制和使用安全有着十分重要的意义。

参 考 文 献

[1] 徐敬侠，张首国，王林，等.5-溴阿魏酸的合成研究 [J].化学试剂，2012，34（5） ：463-466.

[2] 黄华永，张鲁勉，郑锦鸿.5-溴阿魏酸的合成及其清除自由基研究 [J].汕头大学医学院学报，2005，18（3） ： 129-131.

[3] 李全斌，何开勇，吴建萍.阿魏酸含量测定方法研究进展[J].中医药导报，2011，17（3）： 117-119.

[4] 黄罗生，郭健新，刘咏梅，等.HPLC测定阿魏酸含量的探讨[J].中成药，2004，26（2）： 134-136.

[5] 何玲玲.高效液相色谱法测定当归养血丸中阿魏酸含量[J].中国医药导报，2011，8（3）： 60-62.

[6] 顾民，张亮，张正行.HPLC测定逍遥散及当归中阿魏酸的含量[J].中成药，2000，22（5）： 342-344.

[7] ChP（中国药典）.2010.VolⅡ（二部）：Appendix （附录）V D

[8] 夏明，董晓烨.当归养血丸中阿魏酸的含量测定[J].医药导报，2010，29（1）：103-104.

[9] 马宏达，李阳，赵庆春，等.高效液相色谱法测定天宁颗粒中阿魏酸含量[J].医药导报，2012，31（7）：918-920.endprint

按照“2”项下的色谱条件，分别取各破坏溶液20?L进样，记录色谱图，见图2。 通过破坏试验可以看出BL 在碱、氧化条件下比较稳定，放置期间有关物质略有增加，在酸性条件下极不稳定，有关物质增加明显，但有关物质均与主峰分离良好，不干扰样品测定，说明该方法专属性好。

5 方法学考察

5.1 线性关系考察

精密称取BL对照品（批号：20121101）约4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分别置于50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶并稀释成约0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度对照品溶液。分别取上述溶液20?L进样测定，记录色谱图。以峰面积A对浓度C（mg·mL-1）进行线性回归，得回归方程 A=84486C-327332（r = 0.9996），表明BL在0.08～0.32mg·mL-1浓度范围内呈良好线性关系。

5.2 仪器精密度试验

取浓度为0.20mg/mL对照品溶液，连续进样6次，每次20?L，以峰面积计算，所得RSD为0.57%（n=6），表明测定时的仪器精密度良好。

5.3 重复性试验

取同一批号的BL供试品按“3.2”项下方法操作，配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3个浓度的标准溶液，每个浓度平行配制3份，共9份，照“2”项下色谱条件测定，按外标法以峰面积计算样品含量，测得平均含量为100.35%，RSD为0.50%（n=9），表明方法重复性良好。

5.4 稳定性试验

取室温下放置的低、中、高3个浓度的供试品溶液，各取20?L在0，4，6，8，10，12h的条件下，按照“2”项下色谱条件测定峰面积，测得RSD分别为1.7%、1.4%、1.3%，表明供试品溶液在12h内稳定。

5.5 检测限与定量限

精密吸取“3.1”项下对照品溶液，加甲醇逐级稀释，进样，记录色谱图，在信噪比（S/N）为3：1时测得检测限为8ng，在信噪比（S/N）为10：1时测得的定量限为36ng。

6 样品含量测定

按“3”项下的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液，各取20?L进样，按外标法以峰面积计算样品含量，结果表明，3批样品含量均在99.0%以上（见表1）。

7 有关物质测定

取BL供试品约20mg，精密称定，置25mL棕色量瓶中，加甲醇适量，超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得0.80mg/mL的溶液作为供试品溶液。精密移取此溶液适量，用甲醇稀释100倍，得自身对照溶液。以不加校正因子主成分自身对照法计算有关物质的含量[7]。结果表明，有关物质均在1%以内（见表1）。

8 讨论

8.1 波长的选择

取BL对照品溶液进行紫外扫描显示其最大吸收波长在228nm和317nm处，其中228nm处的吸收值最高，因此选择228nm用于BL的含量测定，保证测定时有较高的灵敏度。

8.2 柱温的选择

考察了25℃、30℃、40℃的不同柱温下对样品分离效果的影响，实验表明，采用40℃的柱温，可减小流动相粘度、降低柱压、缩短出峰时间并改善分离效果，故将柱温定为40℃。

8.3 流动相的选择

根据BL的化学性质，考虑采用酸性流动相可以获得较好效果。经过实验比较采用甲醇-乙酸-水系统作为流动相，并且变换流动相比例和乙酸浓度，最终确定流动相为甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V），此条件下分离效果最好，保留时间适中。

8.4 稳定性考察

由于BL的结构特性，通常在溶液中不稳定，且见光易分解[8-9]，考察了BL溶液在透明量瓶和棕色量瓶中的稳定性，发现BL溶液在透明量瓶放置8小时后含量显著降低，而在棕色量瓶中的放置12小时含量变化不大，RSD小于2.0%，但是随着时间增长含量仍会缓慢降低。故在试验过程中需采取避光措施，并于配制后尽快使用。

8.5 结论

综上所述，本方法操作简便且检测限、定量限、精密度、重复性等均符合要求，故本法适用于对BL含量及其有关物质进行测定，对于BL的质量控制和使用安全有着十分重要的意义。

参 考 文 献

[1] 徐敬侠，张首国，王林，等.5-溴阿魏酸的合成研究 [J].化学试剂，2012，34（5） ：463-466.

[2] 黄华永，张鲁勉，郑锦鸿.5-溴阿魏酸的合成及其清除自由基研究 [J].汕头大学医学院学报，2005，18（3） ： 129-131.

[3] 李全斌，何开勇，吴建萍.阿魏酸含量测定方法研究进展[J].中医药导报，2011，17（3）： 117-119.

[4] 黄罗生，郭健新，刘咏梅，等.HPLC测定阿魏酸含量的探讨[J].中成药，2004，26（2）： 134-136.

[5] 何玲玲.高效液相色谱法测定当归养血丸中阿魏酸含量[J].中国医药导报，2011，8（3）： 60-62.

[6] 顾民，张亮，张正行.HPLC测定逍遥散及当归中阿魏酸的含量[J].中成药，2000，22（5）： 342-344.

[7] ChP（中国药典）.2010.VolⅡ（二部）：Appendix （附录）V D

[8] 夏明，董晓烨.当归养血丸中阿魏酸的含量测定[J].医药导报，2010，29（1）：103-104.

[9] 马宏达，李阳，赵庆春，等.高效液相色谱法测定天宁颗粒中阿魏酸含量[J].医药导报，2012，31（7）：918-920.endprint

按照“2”项下的色谱条件，分别取各破坏溶液20?L进样，记录色谱图，见图2。 通过破坏试验可以看出BL 在碱、氧化条件下比较稳定，放置期间有关物质略有增加，在酸性条件下极不稳定，有关物质增加明显，但有关物质均与主峰分离良好，不干扰样品测定，说明该方法专属性好。

5 方法学考察

5.1 线性关系考察

精密称取BL对照品（批号：20121101）约4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分别置于50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶并稀释成约0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度对照品溶液。分别取上述溶液20?L进样测定，记录色谱图。以峰面积A对浓度C（mg·mL-1）进行线性回归，得回归方程 A=84486C-327332（r = 0.9996），表明BL在0.08～0.32mg·mL-1浓度范围内呈良好线性关系。

5.2 仪器精密度试验

取浓度为0.20mg/mL对照品溶液，连续进样6次，每次20?L，以峰面积计算，所得RSD为0.57%（n=6），表明测定时的仪器精密度良好。

5.3 重复性试验

取同一批号的BL供试品按“3.2”项下方法操作，配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3个浓度的标准溶液，每个浓度平行配制3份，共9份，照“2”项下色谱条件测定，按外标法以峰面积计算样品含量，测得平均含量为100.35%，RSD为0.50%（n=9），表明方法重复性良好。

5.4 稳定性试验

取室温下放置的低、中、高3个浓度的供试品溶液，各取20?L在0，4，6，8，10，12h的条件下，按照“2”项下色谱条件测定峰面积，测得RSD分别为1.7%、1.4%、1.3%，表明供试品溶液在12h内稳定。

5.5 检测限与定量限

精密吸取“3.1”项下对照品溶液，加甲醇逐级稀释，进样，记录色谱图，在信噪比（S/N）为3：1时测得检测限为8ng，在信噪比（S/N）为10：1时测得的定量限为36ng。

6 样品含量测定

按“3”项下的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液，各取20?L进样，按外标法以峰面积计算样品含量，结果表明，3批样品含量均在99.0%以上（见表1）。

7 有关物质测定

取BL供试品约20mg，精密称定，置25mL棕色量瓶中，加甲醇适量，超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得0.80mg/mL的溶液作为供试品溶液。精密移取此溶液适量，用甲醇稀释100倍，得自身对照溶液。以不加校正因子主成分自身对照法计算有关物质的含量[7]。结果表明，有关物质均在1%以内（见表1）。

8 讨论

8.1 波长的选择

取BL对照品溶液进行紫外扫描显示其最大吸收波长在228nm和317nm处，其中228nm处的吸收值最高，因此选择228nm用于BL的含量测定，保证测定时有较高的灵敏度。

8.2 柱温的选择

考察了25℃、30℃、40℃的不同柱温下对样品分离效果的影响，实验表明，采用40℃的柱温，可减小流动相粘度、降低柱压、缩短出峰时间并改善分离效果，故将柱温定为40℃。

8.3 流动相的选择

根据BL的化学性质，考虑采用酸性流动相可以获得较好效果。经过实验比较采用甲醇-乙酸-水系统作为流动相，并且变换流动相比例和乙酸浓度，最终确定流动相为甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V），此条件下分离效果最好，保留时间适中。

8.4 稳定性考察

由于BL的结构特性，通常在溶液中不稳定，且见光易分解[8-9]，考察了BL溶液在透明量瓶和棕色量瓶中的稳定性，发现BL溶液在透明量瓶放置8小时后含量显著降低，而在棕色量瓶中的放置12小时含量变化不大，RSD小于2.0%，但是随着时间增长含量仍会缓慢降低。故在试验过程中需采取避光措施，并于配制后尽快使用。

8.5 结论

综上所述，本方法操作简便且检测限、定量限、精密度、重复性等均符合要求，故本法适用于对BL含量及其有关物质进行测定，对于BL的质量控制和使用安全有着十分重要的意义。

参 考 文 献

[1] 徐敬侠，张首国，王林，等.5-溴阿魏酸的合成研究 [J].化学试剂，2012，34（5） ：463-466.

[2] 黄华永，张鲁勉，郑锦鸿.5-溴阿魏酸的合成及其清除自由基研究 [J].汕头大学医学院学报，2005，18（3） ： 129-131.

[3] 李全斌，何开勇，吴建萍.阿魏酸含量测定方法研究进展[J].中医药导报，2011，17（3）： 117-119.

[4] 黄罗生，郭健新，刘咏梅，等.HPLC测定阿魏酸含量的探讨[J].中成药，2004，26（2）： 134-136.

[5] 何玲玲.高效液相色谱法测定当归养血丸中阿魏酸含量[J].中国医药导报，2011，8（3）： 60-62.

[6] 顾民，张亮，张正行.HPLC测定逍遥散及当归中阿魏酸的含量[J].中成药，2000，22（5）： 342-344.

[7] ChP（中国药典）.2010.VolⅡ（二部）：Appendix （附录）V D

[8] 夏明，董晓烨.当归养血丸中阿魏酸的含量测定[J].医药导报，2010，29（1）：103-104.

[9] 马宏达，李阳，赵庆春，等.高效液相色谱法测定天宁颗粒中阿魏酸含量[J].医药导报，2012，31（7）：918-920.endprint