超声波辅助淀粉双酶水解技术及其机理

王振斌 赵 帅 邵淑萍 王 玺

(江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013)

淀粉是一种天然半结晶颗粒结构的高聚物，存在结构和性能缺陷，结晶区分子排列紧密，导致水、酶及多数化学试剂不易接触到结晶区内分子，从而表现出不溶于冷水、淀粉糊易老化脱水、缺乏乳化力，以及淀粉糊在酸、热和剪切力作用下不稳定，化学反应效率较低等现象［1］。

随着淀粉工业的不断发展，淀粉糖化工艺在制糖、酒精、有机酸发酵等行业中的地位日益重要。然而目前存在的淀粉利用率低下等问题，已经成为淀粉产业发展的瓶颈，寻找提高原料淀粉转化率的有效途径成为研究的热点之一。

超声波是频率高于20 kHz的声波，是一种弹性机械波，近年来在物理、生物、化学等领域中已有广泛应用。超声波处理能使生物质高分子的形态结构和超微结构发生明显变化，有利于提高酶的可及度和化学反应性能［2－10］。目前还未见对超声波辅助液化酶和糖化酶双酶法水解淀粉以提高其转化率的研究报道。

本试验采用超声波辅助液化酶和糖化酶水解淀粉，并分析其作用机理，以期提高淀粉利用率，对开发较高活性的淀粉改性产品起到积极的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1材料

水磨糯米粉:金坛市江南制粉有限公司;高温α－淀粉酶(20 000 U/mL)、糖化酶(100 000 U/g):江苏锐阳生物科技有限公司。

1.1.2 主要仪器

JY92－ⅡDN型超声波细胞粉碎机:宁波新芝生物科技股份有限公司;HH－A型恒温水浴搅拌器:江苏金坛市中大仪器厂;UV－1601型紫外可见分光光度计:北京北分瑞利分析仪器有限公司;JSM－7001F型扫描电子显微镜:日本电子株式会社;NEXUS 0410型红外分光光度计:美国热电尼高力公司。

1.2 试验方法

1.2.1 淀粉双酶水解工艺

将淀粉和蒸馏水按一定比例进行混合，然后用0.1 mol/L 的 HCl溶液调 pH 值为 5.6 ±0.2，加入液化酶(耐高温α－淀粉酶10 U/g原料)，于95℃恒温水浴搅拌器中进行液化反应，液化完成后，冷却至60℃，用HCl溶液调pH值为2.2，灭酶30 min，然后用 1 mol/L NaOH 调 pH 4.2～4.4，加入糖化酶(糖化酶300 U/g原料)，放入60℃恒温水浴搅拌器中进行糖化反应。

1.2.2 超声辅助淀粉双酶水解工艺

液化过程超声处理:称量一定质量的淀粉和蒸馏水，调浆成质量浓度10%～30%的淀粉乳。取200mL淀粉乳于300 mL烧杯中，调pH，烧杯放入95℃恒温水浴搅拌器中，将超声波变幅杆插入淀粉乳液面以下2 cm，磁力搅拌转速50%，超声(工作时间/间歇时间=2 s/4 s)辅助液化一定时间，液化完成后，冷却，灭酶，测其液化值，然后按1.2.1节的方法进行糖化，测其DE值。

糖化过程超声处理:称量一定质量的淀粉和蒸馏水，调浆成质量浓度10%～30%的淀粉乳。取200 mL淀粉乳于300 mL烧杯中，然后按1.2.1方法进行液化，灭酶，液化完成后，将超声波变幅杆插入淀粉乳液面以下2 cm，磁力搅拌转速50%，超声(工作时间/间歇时间=2 s/4 s)辅助糖化一定时间，糖化完成后，冷却，测其DE值。

1.3 分析方法

1.3.1 液化值的测定

采用DNS法进行。取淀粉液化液1 mL，定容至100 mL，过滤，取1 mL 滤液，参考赵凯等［11］的方法，绘制标准曲线(图1)，并按照式(1)计算液化值。

式中:A为吸光值;n为稀释倍数。

图1 葡萄糖标准曲线

1.3.2 DE 值测定

参考GB/T 22428.1—2008淀粉水解产品 还原力和葡萄糖当量测定。

1.3.3 电镜扫描

在60℃水浴中，将20%原淀粉乳样品进行0、100、200、300 W超声处理，处理时间为10 min，冻干，密封保存。测试时将样品置于扫描电子显微镜中观察，拍摄具有代表性的颗粒形貌。

1.3.4 溶解度的测定方法

准确称取纯干糯米淀粉样品2.000 0 g，在搅拌条件下缓慢加入100 mL蒸馏水中，在功率100 W，频率 20 kHz，温度 20、40、60、80、100 ℃ 的超声波环境下处理10 min，冷却，3 000 r/min离心15 min。取上清液25 mL，110℃干燥8 h，称重，试验重复3次。溶解度以淀粉溶解的质量占原来淀粉质量的百分比计算。

1.3.5 淀粉－碘复合物吸收光谱分析

取质量浓度0.01%的淀粉乳8 mL，加入0.2 mL碘液(I22.0 mg/mL+KI 20 mg/mL)，混匀静置 10 min，用分光光度计从400～900 nm做连续波长扫描，以稀碘液(0.2 mL上述碘液+8 mL蒸馏水)作空白。

1.3.6 红外光谱分析

采用KBr压片法。取少量研磨后的淀粉和KBr混合物粉末，压片后置于红外光谱仪内全波段扫描(扫描范围:4 000～400 cm－1)，绘出红外光谱图。对比超声处理前后淀粉的红外谱图，考察超声作用对淀粉分子基团及结晶度的影响。

1.3.7 耐高温α－淀粉酶活力测定

参考GB 8275—2009食品添加剂α－淀粉酶制剂。

1.4 数据处理

采用Originpro 7.5统计分析软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助淀粉乳液化对其液化值及DE值的影响

超声波对淀粉乳液化过程中液化值及DE值的影响的结果如图2所示。可以看出，在淀粉乳浓度20%，超声波功率100 W，超声时间10 min，总液化时间50 min条件下，超声波处理的淀粉乳与未加超声波处理的淀粉乳相比，其液化值从22.67 mg/mL升到38.86 mg/mL，DE 值从82.70%升到94.30%。其原因一方面可能是超声波对淀粉乳的作用，如:1)超声波作用破坏淀粉颗粒表面的水束层，使水分渗入淀粉颗粒，有利于淀粉酶对淀粉的水解;2)超声波“空穴效应”产生的剪切力切断淀粉的长链，有利于淀粉的酶解;3)超声波产生的自由基能够攻击淀粉分子，导致1，4－糖苷键的断裂，淀粉长链暴露出大量非还原性末端，为酶解提供了更多的底物;4)超声波的机械搅拌作用使整个反应体系更均匀，底物与酶活性部位的接触频率增加。另一方面可能是超声波对酶的作用，如:1)超声波空穴作用引起的水和空气间界面面积增大，扰乱了酶分子周围环境，如氢键和疏水作用，导致酶分子构象的变化;2)超声波产生剪切力和冲击波造成酶分子结构的变化，表现出酶活的变化。因此，超声波对酶的影响，既可表现为激活酶的活性，促进酶的催化作用，也可表现为钝化酶的活性，降低酶的催化速度，其作用效果受超声波条件的影响［12－14］。

图2a是超声波功率对淀粉酶解效率的影响结果。淀粉液化过程中，在淀粉乳浓度20%，总液化时间50 min，液化起始施加超声波10 min，超声波功率分别为 0、50、100、150、200、250 W 条件下，淀粉乳的液化值及DE值随着超声波功率的增加出现了先升后降的趋势，在超声波功率100 W时，液化值和DE值均达到最大值30.67 mg/mL和94.30%。分析其原因，可能是因为随着超声波功率的增加，淀粉颗粒变小，溶解度增加，或者淀粉酶的空间结构改善，从而表现为淀粉的液化值和DE提高;继续增加超声波功率，过高的超声波能量破坏了淀粉酶的空间结构，酶活性反而降低，使得淀粉的液化值和DE下降。

图2 超声波辅助淀粉乳液化过程对其液化值及DE值的影响

图2b是超声波时间对淀粉酶解效率的影响结果。在超声波功率100 W的条件下，液化起始施加超声波0、6、8、10、12、14 min，淀粉乳液化值和 DE 值随着超声时间的延长，淀粉乳的液化值和DE值也出现了先升后降的趋势，在超声时间10 min时，液化值和DE值达到最大值30.67 mg/mL和94.3%。分析其原因，可能是因为随着超声波时间的延长，有利于淀粉的溶解、酶的空间结构改善和淀粉与酶的有效接触几率的提高，而超声波处理时间过长，使得淀粉酶空间结构破坏，酶活性降低。

图2c是淀粉乳浓度对超声波辅助淀粉酶解效率的影响。在超声波功率100 W，液化起始施加超声波10 min的条件下，淀粉乳浓度分别为10%、15%、20%、25%、30%时，随着淀粉乳浓度的增加，其液化值和DE值同样出现先升后降的趋势。在淀粉乳浓度达到20%时，DE值达到最大值94.30%，液化值为30.67 mg/mL。在淀粉乳达到25%时，液化值达到最大值38.86 mg/mL，DE值为90.96%。分析其原因，可能是因为随着淀粉乳浓度的增加，底物与酶有效碰撞几率增加，从而提高了酶解效率;过高的淀粉乳浓度，一方面降低了酶解体系的传质系数，另一方面阻碍了超声波在体系中传递，底物与酶分子反应后的产物不易及时分离，新的酶解反应界面难以形成，降低了淀粉酶解的效率。

2.2 超声波辅助淀粉乳糖化对其DE值的影响

在淀粉酶解过程中，先不加超声波液化50 min，然后进行超声波辅助糖化，其DE值的变化如图3所示。可以看出，在超声功率150 W，超声时间10 min，淀粉乳浓度20%的条件下，超声辅助糖化的淀粉乳与未加超声波相比，淀粉乳的DE值由82.7%上升到87.31%。从图3a、3b和图3c可以看出，在淀粉糖化过程中，超声波功率、超声波时间和淀粉乳浓度对淀粉乳DE值的影响均表现出先升后降的趋势，这与其在淀粉液化过程中对淀粉液化值和DE值的影响趋势一致。在超声波功率150 W、超声波时间10 min、淀粉乳浓度20%时，DE值达到最大值87.31%，低于超声波辅助液化时的94.30%，说明超声波辅助淀粉液化与超声波辅助糖化相比较，具有显著的优势。分析其原因，可能是因为超声波在一定程度上可以提高淀粉乳的糖化，而淀粉的液化和糖化是一个连续的酶解过程，液化比糖化更为重要;超声波辅助液化，有利于淀粉大分子的降解，可酶解淀粉的比率提高，为糖化过程提供了充足的底物。

图3 超声波辅助淀粉乳糖化过程对DE值的影响

3 讨论

研究超声波对淀粉糖化过程的影响，体现在超声波对淀粉特性和超声波对淀粉糖化过程中所涉及到的酶的影响。研究超声处理后淀粉理化特性变化，作用机理及开发高活性的淀粉改性产品都有重要意义。其次，超声波释放的能量促使酶分子构象发生改变，导致酶分子的生物学功能发生变化，主要体现在超声波对酶活力的促进作用和钝化作用。超声波对酶的作用由于超声波处理的条件和强度的不同对酶的作用也不同。

3.1 超声波功率对淀粉乳微观形态影响的分析

由图4可见，糯米原淀粉表面平滑，无小孔裂缝或破面。从图4b到图4d可以看到，随着超声功率的增加，表面受侵蚀的淀粉颗粒增多，空洞变大，变深，裂纹增多，颗粒内部受侵蚀出现凹陷甚至缺损。由于淀粉颗粒内部主要是非结晶区，外层为坚固的结晶区，对化学试剂和酶有较强的抵抗能力，所以化学试剂一般很难渗透进入未经处理的原淀粉颗粒内部。结果表明，超声作用破坏了淀粉颗粒表层结晶结构。因此，根据淀粉颗粒结构的变化能较好的解释超声处理能促进淀粉化学反应活性［15］。

图4 不同超声功率下淀粉乳微观形态电镜扫描图

3.2 红外光谱分析

由于淀粉是一种多晶高聚物，结晶高聚物在红外光谱图上具有特定的结晶敏感吸收带，其强度与结晶度有关，结晶度增加，结晶区强度增大，结晶度下降，无定形区强度增大。因此，利用晶带可以测定结晶聚合物的结晶度。根据Nelson等［18］测定结晶度的方法得到淀粉红外结晶指数计算公式［17］:

式中:N－O'KI为红外结晶指数，T1158和T2931分别为1 158 cm－1和2 931 cm－1的透光率。

图5中1 158 cm－1处的吸收峰代表C－O－C不对称伸缩振动，2 931 cm－1处的吸收峰代表C－CH2－C的不对称伸缩振动，利用这2个伸缩振动可以较好地表征淀粉的结晶度变化。

由图5可见，超声波处理后淀粉与原淀粉相比，各特征基团的吸收峰位置与原淀粉相差不大，没有新的吸收峰出现，仍具有原有官能团，说明超声波未破坏淀粉的原有基本结构，没有新的化合物产生，但1 158 cm－1和2 931 cm－1附近谱带强度发生了变化。按式(2)计算超声波处理前后淀粉的红外结晶指数，结果见表1，从未经处理时的1.689下降到1.370，说明超声波破坏了淀粉结晶结构。空化气泡产生的高压和局部激流有足够的剪切力来打破聚合链，导致淀粉结晶区甚至整个淀粉颗粒的断裂，这也是淀粉活性增加的主要原因［18－19］。

图5 淀粉红外光谱图

表1 超声波对淀粉结晶指数的影响

3.3 淀粉－碘复合物分析

淀粉是白色无定形粉末，由直链淀粉(占10%～30%)和支链淀粉(占70%～90%)组成。直链淀粉能溶于热水而不呈糊状，支链淀粉不溶于水，热水与之作用则膨胀而成糊状。其中溶于水中的直链淀粉，呈弯曲形式，并借分子内氢键卷曲成螺旋状。这时加入碘酒，其中碘分子便钻入螺旋当中空隙，并借助范得华力与直链淀粉联系在一起，从而形成络合物。这种络合物能比较均匀地吸收除蓝光以外的其他可见光，从而使淀粉变为深蓝色。

图6 经不同时间超声处理的淀粉与碘形成复合物的吸收光谱

由图6可见，随超声波处理时间的延长，淀粉－碘复合物的吸光度变大，表明直链淀粉在增加，超声波致使部分支链断裂，淀粉与碘的结合能力增强。可见，超声波对淀粉大分子链的降解是有利的，而且这种降解作用随着时间的延长越明显。

3.4 超声波对糯米淀粉溶解度的影响

由图7可知，糯米粉溶解过程经超声处理后，其溶解度增加，在100℃时，溶解度由6.2%上升至21.5%，显著高于为超声处理组。超声波能在较短时间内破坏淀粉结晶区，颗粒表面及内部均遭到侵蚀，淀粉与水分子间缔合增加，淀粉溶解度增大［20］。由于淀粉经超声处理，其颗粒表面及结晶结构受到破坏，结晶度下降，淀粉酶扩散阻力下降，这也对淀粉的酶解过程有利。

图7 超声波处理对不同温度淀粉溶解度的影响

3.5 超声波对α－淀粉酶酶活的影响

由图8可知，α－淀粉酶经过不同功率的超声处理后，酶活力出现变化，激活酶的最适功率为100 W，此时酶活力比对照升高12.33%。由图9可知，当α－淀粉酶经过100 W的超声处理不同时间后，酶活力出现变化，对酶活力提高最多的处理时间为10 min，此时酶活力比对照提高15.29%。其最佳条件为功率100 W，超声处理时间10 min。可以看出，不同条件的超声处理对酶产生不同的影响，可激活酶的活性，促进酶的催化作用，也可钝化酶的活性［21］。

图8 超声功率对α－淀粉酶酶活的影响

图9 超声时间对α－淀粉酶酶活的影响

4 结论

4.1 在超声功率100 W，超声时间10 min，淀粉乳浓度25%的条件下，淀粉乳液化值及DE值从未处理样 品 的 19.89mg/mL、82.06% 分 别 提 高 到30.67 mg/mL、94.56%。

4.2 超声波处理对淀粉特性及酶活的影响包括:淀粉颗粒在超声波处理后，其颗粒表面出现凹陷和断裂，受侵蚀的颗粒数量增多;溶解度提高;淀粉分子发生降解，淀粉链断裂，直链淀粉含量增加;超声作用没有改变淀粉原有分子基团，但破坏了淀粉结晶结构，结晶度下降;适宜的超声波条件使得α－淀粉酶活力提高，这些都有利于淀粉的酶解。

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