Penicillium sp.1407产纤维素酶的发酵条件优化

朱晓媛 胡 铁 张 蕾 蒋丽娟 黎继烈

(中南林业科技大学经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室1，长沙 410004)

(广州航海学院2，广州 510725)

纤维素酶是水解纤维素类物质的一组酶的总称，广泛应用于食品、饲料、农副产品深加工、新能源生产等领域。纤维素酶作为新型饲料添加剂，显著提高饲料消化率和利用率，改善家禽生产性能［1－2］。近年来，纤维素酶在农产品深加工及副产品综合利用方面受到越来越多的关注。利用纤维素酶水解秸秆、稻壳等农业副产品制备还原糖，进而生产燃料乙醇、乳酸等［3－4］。利用单一纤维素酶或以纤维素酶为主的复合酶辅助提取植物油如玉米胚芽油［5］、菜籽油［6］、橡胶籽油［7］等，显著提高油脂得率。另外，新型纤维素酶改性农业秸秆制备的水体溢油吸附剂性能良好，绿色环保，具有较好的应用前景［8］。然而，纤维素酶的高成本成为限制其大规模生产应用的瓶颈［9］。纤维素酶来源广泛，细菌、放线菌和真菌均可生产纤维素酶。细菌和放线菌生产的纤维素酶是胞内酶，不仅产量低，而且对结晶纤维素不具酶活性［10］。因而纤维素酶大多是由丝状真菌生产，包括曲霉、木霉和青霉等。曲霉分泌的葡聚糖纤维二糖水解酶活性低，木霉无法利用木质素且分泌的β－葡萄糖苷酶活性低，因而在一定程度上限制了其应用生产。青霉具有分泌纤维素酶组分齐全、酶活较高的生物学特性，而且具有易培养和生长快的优势［11］。然而，目前已报道的青霉纤维素酶生产水平较低，酶活较低［12－13］，不能满足日益增长的市场需求。本试验以实验室自行分离得到的高产菌株青霉Penicillium sp.1407为研究菌株，利用廉价的麸皮作为碳源，采用单因素和Box－Behnken试验对其进行发酵条件优化，旨在获得最优培养条件，提高目标菌种产纤维素酶效率。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种:本实验室自行分离，经鉴定为青霉Penicillium，命名为 Penicillium sp.1407。

活化培养基:麸皮5%、琼脂2%。

种子培养基:PDA培养基、马铃薯20%、蔗糖2%。

发酵培养基:麸皮2.95%、药媒3.18%、胰蛋白胨0.4%、微晶纤维素 3.79%、磷酸二氢钾 0.25%、硫酸镁 0.03%、氯化钙0.03%、硫酸铵 0.2%。

试剂:葡萄糖、磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素钠、酒石酸钾钠、苯酚、3，5－二硝基水杨酸、亚硫酸钠、氢氧化钠等，均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

将斜面保存菌种移接于新鲜的活化培养基上，28℃，培养5～6 d。再用250 mL摇瓶装种子培养基50 mL，接斜面活化好的菌种两环，在28℃、摇床转速180 r/min条件下培养1～2 d制备种子液。以一定接种量将种子液转接于发酵摇瓶中，500 mL摇瓶装发酵培养基100 mL，按照一定的发酵条件培养。所得发酵液于8 000 r/min，4℃离心10 min，上清液即为粗酶液。

1.2.2 纤维素酶活力测定

取经40℃预热的稀释粗酶液0.5 mL，加入经40℃预热的CMCNa液1.5 mL，40℃恒温振荡反应20 min，立即加入DNS试剂3 mL，沸水浴中煮沸7 min，终止反应，加入蒸馏水10 mL混匀，冷却后测定还原糖的含量。

纤维素酶活力定义:在pH 4.8，40℃条件下，单位体积纤维素酶每分钟催化底物生成1 μmol葡萄糖的酶量定义为一个酶活力单位(IU/mL)。

1.2.3 单因素试验

《明报》之后，他的江湖早只剩下了武侠的江湖，曾经纵横论政、夜半文章的政论世界早已消失。但如果靠着他的武侠小说，他建造的这个江湖世界也许真的可做到以一人敌一国，那是母语的力量，是他用母语造出来的一个世界。可以说，他创造了一个人的江湖，这里有水深浪阔、风波不息，也曾有侠骨柔情、剑胆琴心，哪怕如今只留下浑浑噩噩、苟苟且且。

由单因素试验确定发酵条件(摇床转速、发酵温度、接种量、初始 pH、发酵时间)对 Penicillium sp.1407产纤维素酶的影响，每组做3个平行试验。

1.2.4 Box－Behnken试验

依据单因素试验结果，选取对发酵过程影响较大的因素进行Box－Behnken试验，运用统计软件SAS 8.1对试验结果进行分析，确定最优发酵参数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 摇床转速对纤维素酶活力的影响

摇床转速对纤维素酶活力的影响如图1所示，摇床转速低于180 r/min时，发酵液中纤维素酶活力较低。这是因为转速过低影响菌丝体的分散，不利于菌种对培养基养分的吸收利用，也不利于菌丝体伸展，抑制其呼吸作用。摇床转速为220 r/min时维素酶活力较高，这是由于加大转速可增大通气量，提高发酵液中溶氧浓度，因而有助于菌体生长并提高菌种产酶活性。但过高转速可能增加剪切力，影响菌丝生长和代谢，不利于产酶。因此选择摇床转速范围为200～230 r/min。

图1 摇床转速对纤维素酶活力的影响

2.1.2 发酵温度对纤维素酶活力的影响

发酵温度对纤维素酶活力的影响结果如图2所示，纤维素酶活力随着温度的递增而呈现出先增后减的趋势，32℃时酶活力最高，是因为微生物的生长代谢和产物合成都需要在合适的温度下进行，在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境。温度的变化不仅影响微生物体内许多生化反应类型，也影响微生物细胞中生化反应的速度。不同微生物都有自己适宜的生长温度范围，温度不同代谢产物的合成与积累也会有所不同。因此选择30～33℃为后续试验培养温度范围。

图2 发酵温度对纤维素酶活力的影响

2.1.3 接种量对纤维素酶活力的影响

分别以接种量为1%、3%、5%、10%、15%的水平进行发酵试验，测定纤维素酶活力，结果如图3所示。接种量低于5%时，纤维素酶活力较低，这可能是因为接种量过小，发酵前期菌体增长缓慢，增殖时间延长，同时影响菌种的活力，不利于产物合成;接种量超过5%之后，纤维素酶活力有所降低，是因为菌体过多导致营养成分不能满足正常的生长代谢或溶氧不足从而影响菌体产酶。接种量为5%时纤维素酶活力最高，因此确定最适接种量为5%。

图3 接种量对纤维素酶活力的影响

2.1.4 初始pH对纤维素酶活力的影响

初始pH对纤维素酶活力的影响如图4所示，纤维素酶活力在初始pH 4.0～6.0之间有较高的酶活，当初始pH为5.0时酶活最高，这是因为初始pH不仅对微生物的生长有影响，还会影响到代谢产物的形成，从而影响纤维素酶的活力。pH影响微生物细胞原生质膜的电荷进而影响营养物质的吸收及代谢产物的渗漏，同时还会影响营养物质和中间代谢产物的离解进而影响到代谢产物的质量和产量。因此选择初始pH 4.5～5.5为最佳初始pH范围。

图4 初始pH对纤维素酶活力的影响

2.1.5 发酵时间对纤维素酶活力的影响

在摇瓶发酵过程中，每隔12 h分别取样测定酶活。发酵时间对纤维素酶活力的影响结果如图5所示，在0～48 h，纤维素酶活力增长缓慢;随着发酵时间延长，酶活逐渐升高，在144 h酶活达到最高，随后酶活呈下降趋势。这是因为青霉纤维素酶是一类胞外酶，在分泌过程中会有高峰期存在，酶在高峰期的稳定性因培养基的不同而具有较大的差异性，且慢发酵时间对纤维素酶的生产具有很大的影响，需要准确控制。因此选择132～144 h为最佳培养时间范围。

图5 发酵时间对纤维素酶活力的影响

2.2 Box－Behnken试验结果与分析

根据单因素试验的结果，选择摇床转速(X1)、发酵温度(X2)、初始pH(X3)、发酵时间(X4)为影响因素，采用Box－Benhnken试验设计对发酵条件进行四因素三水平的响应面分析优化，试验设计及结果如表1～表2所示。

表1 Box－Behnken试验因素与水平

表2 Box－Behnken试验设计与结果

表3 回归模型方差分析

应用统计软件SAS8.1对试验所得数据进行回归分析，结果如表3所示，模型P＜0.01，表明回归模型极显著，相关系数R2=0.961 0，表明该模型拟合程度较好。所得二次回归拟合方程为:

Y=135.52+1.45X1+0.24X2+1.51X3+0.19X4－4.86X1X1+1.14X1X2+4.74X1X3+3.08X1X4－4.94X2X2+5.43X2X3+0.08X2X4－ 4.92X3X3+0.07X3X4－4.76X4X4

对回归方程求解并修整，得到各因素最佳值分别是:发酵温度32℃、发酵时间142 h、初始pH 5.2、转速230 r/min，纤维素酶的酶活达到理论最大值136.16IU/mL。利用Statistica6.0软件根据回归模型进行响应面分析，绘出响应面分析图及其等高线，如图6所示，X1与X3，X1与X4，X2与X3交互影响明显，即发酵温度与初始pH、发酵温度与发酵时间、转速与初始pH交互效应显著。

图6 两因素交互影响纤维素酶活力的响应面和等高线图

2.3 验证试验

根据上述优化的Penicillium sp.1407发酵产纤维素酶的最佳培养条件，即发酵温度32℃、发酵时间142 h、初始 pH 5.2、转速230 r/min，进行3 次平行试验，测得纤维素酶活为(136±0.74)IU/mL，与拟合回归方程最佳预测值相比误差为0.54%，说明回归模型真实可靠。

3 结论

通过单因素和Box－Benhnken试验对Penicillium sp.1407产纤维素酶的发酵条件进行优化。获得最佳发酵条件为发酵温度32℃、发酵时间142 h、初始pH 5.2、转速230 r/min，在该条件下，纤维素酶活可达(136 ±0.74)IU/mL，较优化前提高了17.73%。

纤维素酶应用于农产品深加工及副产品综合利用，可提高农副产物的附加值。但是目前纤维素酶的生产成本较高，因此从发酵水平提高纤维素酶活具有重要的意义，本研究可为进一步放大发酵生产纤维素酶提供理论依据。

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