电针小海与下巨虚穴对十二指肠溃疡大鼠血清肿瘤坏死因子-α及十二指肠核因子-κB的影响

邓石峰，张 泓*，张雨辰，杨璐佳，王珍珍

（1.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410007）

电针小海与下巨虚穴对十二指肠溃疡大鼠血清肿瘤坏死因子-α及十二指肠核因子-κB的影响

邓石峰1，张 泓1*，张雨辰2，杨璐佳1，王珍珍1

（1.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410007）

目的 观察电针十二指肠溃疡（Duodenal ulcer，DU）大鼠“小海”、“下巨虚”后对血清肿瘤坏死因子-α（Tumour Necrosis Factor-α，TNF-α）含量及十二指肠组织核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）表达的影响。方法将40只健康SD大鼠随机分为空白、模型、小海、下巨虚四组，每组雌雄各半，除空白组外均皮下注射盐酸半胱胺建立DU模型大鼠。造模成功并治疗10 d后，肉眼和光镜下分别观察大鼠十二指肠黏膜溃疡情况及组织形态学变化，ELISA法检测大鼠血清中TNF-α含量，免疫组织化学法检测十二指肠NF-κB的表达。结果 与空白组比较，各组大鼠光镜下十二指肠组织病理损伤改变明显，DU肉眼评分、血清TNF-α含量及十二指肠组织NF-κB表达显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，小海、下巨虚组组织损伤有所改善，且DU肉眼评分、血清TNF-α含量及NF-κB表达显著降低（P＜0.01）；与小海组比较，下巨虚组组织损伤恢复较好，且肉眼评分、血清TNF-α含量及NF-κB表达降低（P＜0.01或P＜0.05）。结论 电针小海、下巨虚穴均能对DU起治疗作用，且下巨虚组效果优于小海组，部分证实“合治内府”之“合”主要应指下合穴。其治疗效应可能是通过抑制核因子的活性、降低血清TNF-α等促炎因子的含量来实现的。

十二指肠溃疡；合治内府；电针；肿瘤坏死因子-α；十二指肠核因子-κB；小海；下巨虚；大鼠

对于特定穴中“合穴”的临床应用，《灵枢·邪气脏腑病形》提出了：“荥输治外经，合治内府”、“治内府奈何？取之于合”的原则。大量研究表明[1-3]，针刺合穴对相应脏腑疾病有良好的治疗效果。从具体的选穴来看则是以下合穴为主，很少选用经合穴，如治疗小肠病多以下巨虚为主，极少涉及小海穴[4-5]。那么就小肠腑而言，“合治内府”中的“合”到底是指经合穴还是下合穴，还是两者皆是？针对上述问题，我们选取较为经典的小肠腑病——十二指肠溃疡（Duodenal ulcer，DU）为研究对象，以手太阳小肠经经合穴小海、下合穴下巨虚为刺激点，观察电针后DU大鼠十二指肠溃疡评分、血清肿瘤坏死因子-α（Tumour Necrosis Factor-α，TNF-α）含量及十二指肠组织核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的表达，以初步探讨其对DU可能的治疗机制以及 “合治内府”的部分内涵，同时也为特定穴临床应用的相对特异性研究进行一些有益的尝试。

1 材料和方法

1.1 动物与分组

健康SD大鼠40只，SPF级，雌雄各半，体质量205～235 g，饲养温度20～25℃，湿度50%～70%（动物及饲料由湖南中医药大学动物实验中心提供，合格证编号：4304701041）。大鼠适应性饲养1 w。于实验前24 h禁食不禁水，随机分为4组：空白组、模型组、小海组和下巨虚组，每组10只，雌雄各半。

1.2 主要材料、试剂与仪器

主要材料和试剂：盐酸半胱胺（美国sigma公司进口），毫针 （规格0.3 mm×25 mm，苏州医疗用品厂），即用型SABC免疫组化染色试剂盒、棕黄色DAB显色剂 （武汉博士德公司），NF-κB多克隆抗体（中杉金桥），TNF-α酶联免疫分析试剂盒（上海国药生物）。

主要仪器：SDZ-V型电子针疗仪 （苏州医疗用品厂有限公司），CBV-1500A型无菌工作台（上海瑞仰净化装备有限公司），TGL16M 台式高速冷冻离心机 (长沙科威实业有限公司)，MoticTeK3.1图像采集系统（厦门产），OLYMPUSBx-70显微镜成像系统（日本OLYMPUS公司）。

1.3 造模方法

空白组注射生理盐水作为对照，其余各组采用Szabo法[6]注射盐酸半胱胺溶液制造DU大鼠。在大鼠禁食不禁水24 h后，皮下注射10%盐酸半胱胺生理盐水溶液300 mg/kg大鼠体质量，所有大鼠注射部位约当大鼠右臀部。造模24 h后，为了保持溃疡的慢性过程，继续给造模大鼠饮用1%盐酸半胱胺生理盐水溶液。并观察大鼠的精神活动、饮食饮水等情况。

1.4 治疗方法

穴位定取：根据林文注[7]主编《实验针灸学》及华兴邦制定的《实验动物图谱》提供的方法，并参照人体腧穴骨度分寸法量取：（1）小海位于大鼠前肢，前肘突与肱骨髁之间的凹陷中，直刺5 mm；（2）下巨虚位于大鼠后肢，约当下肢膝关节后外侧，胫骨外上髁下约15 mm处，直刺5 mm。处理方法：在造模成功后第2天（造模后24 h）起，分别给予各组大鼠不同的处理：空白组大鼠不做任何处理；模型组大鼠只捆绑不针刺，每次30 min；小海组与下巨虚组大鼠捆绑后分别针刺双侧的小海穴、下巨虚穴，使用电针治疗仪[（疏密波（10/50 Hz），左侧接正极，右侧接负极，以肢体出现震颤为度]，留针30 min。均每天1次，治疗10 d。

1.5 观察指标及检测方法

治疗结束后将各组大鼠麻醉，立即开腹，EP管行腹主动脉采血，之后置于台式高速冷冻离心机4℃、4 000 r/min，离心15 min，取上清液于-70℃低温冰箱保存，用于TNF-α的检测，采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）法，严格按照试剂盒所述步骤操作。

采血后迅速分离十二指肠，沿十二指肠系膜纵轴方向剪开并用冰生理盐水冲洗干净，先于10倍放大镜下行肉眼溃疡评分，取出一块约150 mg左右的肠组织，10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，用于HE染色和NF-κB的免疫组化检测。

肉眼下十二指肠组织黏膜溃疡指数评分：按照Moraes[8]等的方法，并采用其改良后的评分标准[9]评价十二指肠黏膜损伤程度：0分为黏膜正常；1分为黏膜充血、水肿；2分为黏膜糜烂、出血；3分为浅溃疡；4分为深溃疡；5分为溃疡穿孔。

1.6 统计学分析

2 结果

模型组大鼠造模后死亡1只 （死于十二指肠穿孔），小海组、下巨虚组治疗过程中分别死亡2只和1只（死于十二指肠穿孔及急性感染），故纳入统计大鼠共36只。

2.1 各组大鼠十二指肠溃疡肉眼评分比较

空白组大鼠十二指肠黏膜正常；模型组大鼠十二指肠组织黏膜糜烂、出血严重；小海组及下巨虚组黏膜糜烂、出血较轻。结果见图1。

图1 各组十二指肠溃疡组织图

与空白组比，各组DU评分均升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；电针治疗后，小海组和下巨虚组评分较模型组降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；且下巨虚组评分低于小海组，差异有显著统计学意义（P＜0.01），结果见表1。

2.2 各组大鼠光镜下十二指肠黏膜组织形态学改变

光镜下，空白组十二指肠黏膜表面细胞完整，无溃疡性损害，各层组织结构正常，未见萎缩、缺损；模型组大鼠十二指肠黏膜损伤明显，可见明显坏死和广泛的破损、脱落，并见大量炎性细胞浸润；小海组大鼠十二指肠黏膜表面有部分脱落，破损情况较模型组改善，炎性细胞少量集结；下巨虚组大鼠十二指肠黏膜表面有少量破损、脱落。综上所述，小海组、下巨虚组较模型组明显改善，且下巨虚组改善优于小海组，结果见图2。

表1 各组大鼠十二指肠溃疡肉眼评分的比较 （分）

图2 各组光镜下十二指肠组织形态学特征（HE×100）

2.3 各组大鼠血清中TNF-ɑ含量和十二指肠组织NF-κB表达比较

与空白组比，各组血清TNF-α含量及十二指肠组织NF-κB表达均升高，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；电针治疗后，小海组和下巨虚组TNF-α含量及十二指肠组织NF-κB表达均较模型组降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；且下巨虚组TNF-α含量低于小海组，差异有显著统计学意义 （P＜0.01），结果见表2、图3。

3 讨论

十二指肠溃疡是消化系统的常见病、多发病。肠黏膜的糜烂、溃疡是其最基本的病理变化，其并发症包括出血、穿孔、癌变等[10]。形态学检查是判定消化性溃疡（Peptic ulcer，PU）的治疗是否有效的一个非常重要且直观可靠的方法[8，9，11]。 本实验中，采用改良的Moraes方法对DU行肉眼评分，并结合光镜下观察进行评定，能够较好地评价电针的治疗效果。炎症反应在DU发病中具有重要的意义，研究表明，在众多炎性因子中TNF-α水平测定可作为判断PU病变程度及疗效的参考指标[12-13]。本实验中，从大鼠形态学指标及血清TNF-α含量观察分析可知：（1）大鼠DU模型复制成功；（2）电针小肠腑经合穴“小海”与下合穴“下巨虚”可能通过改善十二指肠黏膜的形态结构，降低血清炎症因子的含量，最终对DU产生治疗效应；（3）通过比较可知，“下巨虚”穴的效益要优于“小海”穴，具有相对特异性，就小肠腑而言，“合治内府”之“合”穴，主要应指下合穴。

表2 各组大鼠血清中TNF-ɑ含量和十二指肠组织NF-κB表达比较 （±s）

表2 各组大鼠血清中TNF-ɑ含量和十二指肠组织NF-κB表达比较 （±s）

组别空白组模型组小海组下巨虚组n 10 9 8 9 TNF-α（ng/L）110.76±13.92 361.06±9.45** 317.87±19.69**ΔΔ275.36±14.97**ΔΔ●●NF-κB（光密度值）0.10±0.02 0.30±0.03** 0.19±0.04**ΔΔ0.16±0.04**ΔΔ●

图3 各组光镜下十二指肠粘膜核因子-κB表达（×100）

近年来研究发现NF-κB在炎症性肠病的发生发展中起着重要的作用[14-16]。本实验中，模型组十二指肠组织中NF-κB大量表达，这与戴幸平等[17-18]在PU及溃疡性结肠炎中观察到的一致，这可能意味着在DU发病中，NF-κB受到炎性因子的刺激而活化，并进一步加剧炎症反应，使得血清中TNF-α等炎症因子的含量增高；而电针小海、下巨虚可能通过影响NF-κB进而降低TNF-α等炎性因子的产生，其具体机制有待进一步研究；小海组与下巨虚组之间的差异体现了不同穴位之间的差异性。

综上所述，电针小海穴及下巨虚穴均对DU有治疗作用，且下巨虚穴优于小海穴，就小肠腑而言，“合治内府”之“合”主要应指下合穴，其确切内涵仍需进一步研究；可能的部分治疗机制是通过抑制核因子的表达、降低炎症因子（TNF-a等）的合成与释放来实现。

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（本文编辑 匡静之）

Effects of Electroacupuncture on Serum TNF-α Level and Duodenal Tissue NF-κB Expression in DU Rats

DENG Shifeng1,ZHANG Hong1*,ZHANG Yuchen2,YANG Lujia1,WANG Zhenzhen1
(1.College of Acupuncture and Massage,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;
2.The Second Affiliated Hospital of HUCM,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective By electroacupuncture at Xiaohai and Xiajuxu points on duodenal ulcer model rats,to observe the effect of electroacupuncture on serum TNF-α level and duodenaltissue NF-κB expression,and to analyze their mechanism to which they related,briefly explaining the meaning of He points in curing viscera diseases by He points.Methods Forty SD rats were randomly divided into 4 groups:Blank group,Model group,Xiaohai group and Xiajuxu group.Set up the Duodenal Ulcer rat models through injection of cysteamine hydrochloride at the right buttock.After molding,following electro-acupuncture at rat's XiaoHai and XiaJuXu acupoint,EA parameters density wave (10/50 Hz),a negative electrode on the right and the positive one left, the intensity between 1～3 mA,with limb tremor in degrees needle for 30 minutes once a day for 10 days.After treatment,make DU score by eyes first.Histological changes in the duodenum were observed by light microscopy.ELISA is used to check models'serum TNF-α level and the expression of NF-κB in the duodenum were detected by immunohistochemistry.Results The DU score,serum TNF-α levels and NF-κB expression of Model,Xiaohai and Xiajuxu groups are significantly higher than the Blank group(P<0.01)and the tissue injurychanges are obviously under lightmicroscope.Compared with Modelgroup,the tissue injury changesofXiaohaiand Xiajuxu groups improved obviously,the DU score,serum TNF-α levels and NF-κB levels of Xiaohai and Xiajuxu groups are significantly lower(P<0.01).Compared with Xiaohai group,the tissue injury changes of Xiajuxu group improved well,the DU score,serum TNF-α and NF-κB levels is obviously lower (P<0.01 or P<0.05).Conclusion Electroacupuncture at Xiaohai and Xiajuxu point have treatment effects on DU rats,and the effects of Xiajuxu is obvious better than Xiaohai,which proves Xiajuxu has relative specificity.This result partly confirmed:"He""He Zhi Nei Fu"should refer to the Xia He point.The treatment mechanism of He point might inhibit the activity of NF-κB and reduce the serum TNF-α level.

duodenalulcer;curing viscera diseasesby He points;TNF-α;NF-κB; electro-acupuncture

R245.3；R573.1

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.04.011.036.05

2014-02-18

国家自然科技基金项目（81173327/H2718）。

邓石峰，男，在读硕士研究生，研究方向：针灸对常见病康复机理的研究。

*张 泓，男，教授，博士，博士研究生导师，E-mail：zh5381271@sina.com。