转化生长因子β1及其受体与高碘促成纤维细胞增殖作用的相关性研究

华浅近，祖茂衡，胡琳，庄银苹

·实验研究Experimental research·

转化生长因子β1及其受体与高碘促成纤维细胞增殖作用的相关性研究

华浅近，祖茂衡，胡琳，庄银苹

目的研究转化生长因子β1（TGF-β1）及其受体Ⅰ（TGF-βRⅠ）与高碘促成纤维细胞增殖作用的相关性，探索布-加综合征（BCS）隔膜组织形成机制。方法实验分为5组，空白对照组、溶媒组、KI组、TGF-βRⅠ抑制剂（SD-208）组和SD-208和碘化钾（KI）共同作用组。采用CCK-8法检测TGF-βRⅠ抑制剂对高碘培养环境中成纤维细胞增殖率的影响；采用免疫印迹法检测不同浓度（0、250、500、1 000、2 000、3 000μg/L）碘离子对成纤维细胞TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表达的影响。结果①在1 000μg/L碘培养环境中，KI与SD-208共同作用组成纤维细胞增殖率（1.29±0.41）高于SD-208组（0.52±0.10），而低于KI组（1.70±0.03），差异有统计学意义（P＜0.05）。②1 000μg/L和2 000μg/L高碘组成纤维细胞TGF-β1蛋白相对表达量高于其他各组（P＜0.05）。各组间成纤维细胞TGF-βRⅠ蛋白相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。结论①高碘因素可能通过提高成纤维细胞TGF-β1蛋白表达而促进成纤维细胞增殖；②高碘导致的成纤维细胞增殖可能与BCS隔膜形成相关。

布-加综合征；成纤维细胞；碘；细胞因子类；隔膜阻塞

隔膜阻塞型布-加综合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）的特征是下腔静脉和（或）肝静脉开口处隔膜形成，而隔膜的形成机制至今尚未阐明［1］。近年来国内流行病学研究发现，BCS高发区饮用水碘含量超标，其发病率与水碘含量呈正相关［2］。基础研究发现，BCS的隔膜组织主要由成纤维细胞、内皮细胞、胶原纤维等构成［3］；一定浓度的高碘培养环境能促进成纤维细胞、内皮细胞增殖［4］。另外，隔膜组织中转化生长因子β受体（transforming growth factor-βreceptor，TGF-βR）表达明显高于正常血管壁组织［5］。

本研究在体外高碘环境中培养成纤维细胞，研究高碘促成纤维细胞增殖作用与TGF-β1、TGF-βRⅠ的相关性，以探讨BCS隔膜形成的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株培养

HFL1人肺成纤维细胞（目录号GNHu28）购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞培养于Corning培养皿中，使用F12K培养基（美国Sigma公司），加10%胎牛血清（美国Gibco公司）。于37℃、5%CO2条件的培养箱中静置培养，至细胞贴壁生长汇合即可传代，选取第5～6代细胞用于实验。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测细胞增殖情况取对数生长期的成纤维细胞，经胰酶消化后制备成细胞悬液。用细胞计数板作细胞计数，测定细胞密度，再使用培养基稀释至5×104个/ml。将TGF-βRⅠ抑制剂SD-208（Sigma公司）用二甲基亚砜（DMSO）溶解后再加入双蒸水配成8.5mg/L工作溶液。将分析纯碘化钾（KI）配制成I-浓度为24 mg/L的工作溶液。将细胞悬液接种至96孔板中（密度约为5 000个/孔），分为5组：①空白对照组（每孔加入100μl细胞悬液和20μl F12K培养基），②溶媒组（每孔加入100μl细胞悬液、19μl F12K培养基和1μl DMSO），③KI组（每孔加入细胞悬液100μl、F12K培养基15μl和KI 5μl），④SD-208组（每孔加入细胞悬液100μl、F12K培养基15μl和SD-208 5μl），⑤SD-208和KI共同作用组（联合组，每孔加入细胞悬液100μl、F12K培养基10μl、SD-208 5μl、KI 5μl）。以上各组均作6个复孔。其中③、⑤组I-终浓度为1 000μg/L，④、⑤组SD-208终浓度为1μmol/L。随后于培养箱中静置培养16 h，更换新的F12K培养基，每孔再加入CCK-8工作液10μl，孵育40min。以1个F12K培养基加CCK-8工作液孔作为本底调零，于450 nmol/L波长处测定各孔吸光度（A）值，间接反映细胞数量，各组A值均去除1个最高值和1个最低值。以上实验重复3次。1.2.2 Western印迹法检测TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表达取对数生长期成纤维细胞1∶6传代，培养48代后换液，设空白对照组和高碘组。空白对照组直接使用F12K培养基培养；高碘组在F12K培养基中分别加入碘化钾，使I-终浓度分别为250、500、1 000、2 000和3 000μg/L，再将细胞于培养箱中孵育12 h。用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA法测蛋白浓度、SDS-PAGE电泳、转膜和免疫反应。TGF-β1一抗（Abcam公司）以1∶500稀释，TGF-βRⅠ一抗（Abcam公司）以1∶250稀释，二抗稀释比均为1∶1 000。显色方法为5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/氯化硝基四氮唑蓝（BCIP/NBT）发色显色法。以上条带均以β-actin作为内参照。扫描后采用IPP6.0图像分析软件对特异性条带进行半定量分析，以TGF-β1/β-acting，TGF-βRⅠ/β-acting的灰度值比值评定TGF-β1及TGF-βRⅠ蛋白表达水平。以上实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用SPSS16.0软件。检测结果以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），多个实验组与对照组比较采用最小显著差法（LSD），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同条件影响成纤维细胞的增殖情况

空白对照组与溶媒组细胞增殖率差异无统计学意义（P＞0.05）；KI组细胞增殖率明显高于对照组，SD-208组细胞增殖率明显低于对照组，联合组细胞增殖率高于对照组但低于KI组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同条件影响成纤维细胞的增殖情况（±s）

表1 不同条件影响成纤维细胞的增殖情况（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05

组别标本数成纤维细胞增殖率（A值）空白对照组18 1.06±0.13溶媒组18 1.02±0.11 KI组18 1.70±0.03aSD-208组18 0.52±0.10a联合组18 1.29±0.41a

2.2 不同浓度I-对TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表达的影响

与空白对照组比较，不同I-浓度组的TGF-βRⅠ蛋白相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）；但1 000、2 000μg/L I-浓度组的TGF-β1蛋白相对表达量明显提高（P＜0.05），1 000μg/L与2 000μg/L I-浓度组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2，图1～3。

3 讨论

我们曾检测74例下腔静脉隔膜阻塞型BCS患者下腔静脉血液中TGF-β1浓度，发现明显高于非BCS患者［6］。结合已发现的隔膜组织中TGF-βR表达明显高于正常血管壁组织的结果［5］，我们认为TGF-β家族与BCS隔膜形成存在密切关系。TGF-β是一类促进细胞增殖和转化的细胞因子超家族，是目前公认的对纤维化最重要的调控因子［7］。TGF-β1能促进成纤维细胞过度增殖、分化，继而促进胶原蛋白等细胞外基质（ECM）在肺间质和肺泡间过度积聚［8］。

本研究中使用的SD-208为TGF-βRⅠ激酶抑制剂［9-10］，结果显示KI组细胞增殖率明显高于对照组，与张海涛等［4］发现的碘离子浓度≤3 000μg/L具有促进成纤维细胞增殖和抑制细胞凋亡作用的结果相符。本文中SD-208组细胞增殖率明显低于对照组，表明成纤维细胞增殖依赖于TGF-β1和（或）TGF-βRⅠ作用。联合组细胞增殖率低于KI组但仍高于对照组，表明高碘对成纤维细胞的促增殖作用不仅通过对TGF-β/TGF-βRⅠ途径刺激而实现，还存在其他作用途径。我们前期研究高碘促成纤维细胞增殖作用与碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）、成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）关系发现，高碘因素可通过对FGF/FGFR途径刺激而促进成纤维细胞增殖［11］。

碘对成纤维细胞的增殖和凋亡具有双向效应，较低浓度的碘离子对成纤维细胞增殖起明显的促进作用，随着碘离子浓度的升高促进作用逐渐消失，碘离子浓度较高时成纤维细胞增殖活性受到抑制。前期研究中发现高碘对成纤维细胞FGFR2蛋白表达也存在剂量-效应关系［11］。本研究中，Western印迹结果显示，I-浓度1 000和2 000μg/L组TGF-β1蛋白表达明显提高，表明高碘可通过上调TGF-β1蛋白表达量对成纤维细胞产生促增殖作用，但I-浓度3 000μg/L组的TGF-β1蛋白表达量低于1 000μg/L和2 000μg/L组，与对照组比较无明显差异，说明高碘对成纤维细胞TGF-β1蛋白表达的影响也存在剂量-效应关系。各组中成纤维细胞TGF-βRⅠ蛋白表达量比较无明显差异，表明高碘对成纤维细胞产生促增殖作用并非通过提高TGF-βRⅠ蛋白表达量实现。高碘对TGF-βR其他亚型的蛋白表达是否存在影响还需进一步证实。

表2 不同浓度I-对TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白表达的影响

图1 TGF-β1、TGF-βRⅠ蛋白在不同中I-浓度中的表达

图2 不同I-浓度对TGF-βRI蛋白相对表达量的影响

图3 不同I-浓度对TGF-β1蛋白相对表达量的影响

TGF-β1的过度表达可强化TGF-β1/Smads信号转导通路，能够刺激成纤维细胞有丝分裂促进其增殖，并诱导其转化为肌成纤维细胞而产生ECM［12］。另一方面，抑制基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9等合成，促进蛋白酶抑制剂的合成以阻止基质降解，并调节细胞表面整合素的表达，以增强新生基质与细胞的黏附和组合，使新生基质得以稳定和积聚［13］。TGF-β1的高表达可促进成纤维细胞的增殖和转化导致ECM合成和沉积，稳定新生基质，最终导致纤维化的发生。

本研究发现高碘通过提高成纤维细胞TGF-β1蛋白表达量促进其增殖，这与BCS隔膜组织检测到增殖的成纤维细胞、BCS患者下腔静脉血液中高浓度TGF-β1结果相一致。另外，韩新强等［14］发现下腔静脉隔膜阻塞型（MOVC）BCS患者下腔静脉血液中VEGF的含量明显高于正常人，而TGF-β1在刺激成纤维细胞增殖同时还能诱导成纤维细胞分泌内源性和外源性VEGF［15］。我们推测由于肝静脉开口处的血流切应力、膈肌损伤等因素引起肝静脉开口处血管壁损伤［16］，而患者血液中高碘因素促进损伤处成纤维细胞FGFR2蛋白表达量［11］和TGF-β1分泌，并通过细胞因子间的交互作用促进VEGF等表达提高，进而共同促进细胞增殖、迁移。因此，高碘导致的成纤维细胞增殖可能与隔膜形成存在相关性。

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The effect of TGF-β1，TGF-βRI and high concentration iod ine in the promotion of fibroblast proliferation：correlation study

HUA Qian-jin，ZU Mao-heng，HU Lin，ZHUANG Yin-ping. Department of Interventional Radiology，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu Province 22l002，China

ZUMao-heng，E-mail:cjr.zumaoheng@vip.163.com

ObjectiveTo study the relationship between transforming growth factor-β1（TGF-β1），transforming growth factor-βreceptorⅠ（TGF-βRⅠ）and high concentration iodine in promoting fibroblast proliferation so as to explore the pathogenesis of the membranous formation in Budd-Chiari syndrome.M ethods The experiment included five groups：blank control group，solvent group，KI group，TGF-βRⅠinhibitor group（SD-208）and SD-208 plus KI combination group.①Fibroblasts were cultured in high content of iodine and treated with TGF-βRI inhibitor then the fibroblast proliferation activity was determined by CCK-8 assy.②The protein expressions of TGF-β1 and TGF-βRⅠof fibroblasts in different concentrations of iodine（0，250，500，1 000，2 000 and 3 000 ug/L）were determined by Western-blotmethod.Results①When the culture solution was of 1 000 ug/L iodine concentration，the cell proliferation rate of the SD-208 plus KI combination group（A：1.29±0.41）was significantly higher than that of the control group（0.52± 0.10），but significantly lower than that of the KIgroup（1.70±0.03）with P＜0.05.②Fibroblast TGF-β1 protein relative expression levels in the groups with the iodine concentration of 1 000 ug/L and 2 000 ug/L were significantly higher than those of the other groups（P＜0.05）.No significant difference in fibroblast TGF-βRⅠprotein relative expressions existed between each other groups（P＞0.05）.Conclusion①High concentration of iodinemay promote the proliferation of fibroblasts through raising TGF-β1 protein expression.②Theproliferation of fibroblasts caused by high concentration of iodinemay be related to themembranous formation in Budd-Chiarisyndrome.（JIntervent Radiol，2014，23：431-434）

Budd-Chiari syndrome；fibroblast；iodine；cytokine；membranous obstruction

R543.6

B

1008-794X（2014）-05-0431-04

2013-10-22）

（本文编辑：侯虹鲁）

江苏省科技创新与成果转化专项基金资助项目（BL2012021）；徐州医学院研究生科技创新工程研究项目（XYLC-1220）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.05.016

221002徐州医学院附属医院介入放射科（华浅近、祖茂衡、胡琳）；徐州医学院医学影像学院布-加综合征实验室（庄银苹）

祖茂衡E-mail：cjr.zumaoheng@vip.163.com