药物洗脱球囊抑制下肢动脉狭窄性病变的实验研究

张文俐，杜润，朱政斌，朱劲舟，应晨，刘慧竹，张瑞岩

·实验研究Experimental research·

药物洗脱球囊抑制下肢动脉狭窄性病变的实验研究

张文俐，杜润，朱政斌，朱劲舟，应晨，刘慧竹，张瑞岩

目的探讨新型药物洗脱球囊（DEB）在下肢动脉狭窄性病变（PAD）中可能具有的抑制管腔丢失、减少内膜增生作用。方法以雄性新西兰纯种兔（体重2.5～3.0 kg）为实验对象，于兔腹主动脉近心端及远心端各植入Mustang裸支架1枚，模拟PAD模型，并分别用裸球囊（PTA组）及药物洗脱球囊（DEB组）在血管支架段行后扩张，术后28 d处死动物，收集腹主动脉支架标本，塑料包埋并行Masson染色，比较各组内膜增生程度，同时行DEB药物（紫杉醇）靶点β-微管蛋白免疫组化检测。结果形态学上，与PTA组比较，DEB组内膜增生及管腔狭窄率明显下降。同时β-微管蛋白免疫组化检测显示，与PTA组相比，DEB组血管内膜β-微管蛋白表达量显著增加。结论动物实验初步显示，DEB具有潜在的有效地抑制管腔丢失、减少内膜增生作用，初步证实该新型DEB的优良性能，提示该新型DEB远期应用于临床治疗PAD的潜在可能性。

下肢动脉狭窄性病变；药物洗脱球囊；紫杉醇；内膜增生

下肢动脉狭窄性病变（PAD）主要分为动脉栓塞和血栓形成两类，主要原因多为动脉粥样硬化引起，常导致下肢血液供需不足、疼痛、下肢无脉、间歇性跛行等症状，严重者可导致重症肢体缺血，面临截肢风险，需要及早进行治疗［1］。随着人们饮食结构的改变和人口老龄化，PAD的发病率呈上升趋势，尤其是伴有糖尿病的患者，远端血管病变更为常见，严重影响了患者的健康和生活水平［2-3］。

血管介入治疗以其创伤小、并发症少、恢复快，现已成为临床医师治疗PAD的首选方法［4］。介入治疗的发展经历了经皮腔内血管成形术、裸支架成形术（BMS）、药物涂层支架成形术（DES）、粥样斑块旋切术、经皮机械血栓消融等过程。但由于PAD具有病变弥漫，血管迂曲等特点，限制了以上技术的应用［1］。

球囊扩张方法相对简单，操作时间短，一次可治疗多支动脉狭窄或1支动脉多处狭窄，且较少受动脉管径和部位的限制，大小动脉、关节弯曲处、动脉分叉处、长段狭窄都可施行球囊扩张治疗。但鉴于一些病变血管壁回弹力高、管壁硬度大等原因，下肢动脉狭窄单纯球囊扩张1年后再狭窄率高达32%［5］。为克服球囊扩张成形术后靶病变血管的高再狭窄发生率，药物涂层球囊（DEB）导管系统成为研究热点。国外关于DEB对PAD治疗作用的研究已取得令人满意的结果，并已有成型商品在临床应用。

目前，国内尚无治疗PAD的DEB产品问世。本研究依托微创医疗（上海）器械有限公司成熟的生产与研发体系，自主开发新型紫杉醇涂层球囊（DEB）系统，并研究其对PAD的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物用药与分组

采用雄性新西兰大白兔5只，体重2.5～3.0 kg，正常饲料喂养7 d。术前3 d至术后7 d每天给予阿司匹林100 mg和噻氯匹定500mg灌胃；术后7 d每天给予阿司匹林100 mg灌胃，直到动物处死。采用随机信封法，将实验分为PTA及DEB处理组，于兔腹主动脉近心端及远心端各植入Mustang裸支架（微创医疗器械（上海）有限公司）1枚，并分别用PTA及DEB球囊（2.0mm×18mm）行后扩张。

1.2 方法

1.2.1 手术操作所有动脉造影、支架植入以及球囊扩张均在血管造影机下完成（INNOVA2100，GE，USA）。实验兔用2.5%戊巴比妥钠1ml/kg行耳缘静脉注射麻醉后，置于动物台上，消毒，铺巾，外科学方法暴露右侧下肢股动脉，18 G穿刺针穿刺后引入0.014英寸指引钢丝（Runthrough，Terumo，Tokyo，Japan），按照支架直径∶血管直径1.1∶1比例植入Mustang裸支架，释放压力12～18 atm；送入球囊导管系统，以球囊直径∶血管直径1.1～1.2∶1比例，16～18 atm扩张球囊使之与血管壁紧密接触并持续2 min，释放压力维持1 min，再次相同压力扩张球囊1次，维持1 min；最后撤出球囊，局部创口3/0针线缝合。

1.2.2 标本制备和形态学观察于术后4周按照实验计划处死动物，取其支架覆盖段血管置于4%甲醛溶液中固定。首先取部分血管用于Masson大体染色，标本行丙酮脱水，甲基丙烯酸甲酯包埋，硬组织切片机切片（EXAKT公司德国）、打磨，Masson染色，Zeiss显微镜下观察内膜增生情况。利用AxioVision 4.7（Carl Zeiss MicroImaging德国）图像分析软件将10倍物镜下的血管横切面图像，拼接成完整的血管腔，逐步测算血管腔面积、内弹力膜截面积，得出新生内膜面积及管腔狭窄百分比，并测量血管横截面每枚支架片段外侧至血管腔面的距离，取平均值得出新生内膜厚度。同时参照经典文献对血管损伤程度及管壁炎性指数进行评分。损伤评分如下：①每枚支架片段贴于血管中膜；②每枚支架片段浸入血管中膜，但未穿透；③每枚支架片段穿透血管中膜；最终取总分的平均值。炎性评分标准如下：0分：每枚支架片段周围无炎性细胞；1分：每枚支架片段周围有少量炎性细胞浸润；2分：每枚支架片段周围有中量炎性细胞浸润；3分：每枚支架片段周围有大量炎性细胞浸润；4分：支架片段周围存在肉芽肿，最终取总分平均值。

1.2.3 免疫组化检测另取部分血管行紫杉醇作用靶点β-微管蛋白（β-tublin）免疫组化检测。标本纵向剪开后，于显微镜下用微型手术器械小心分离其中支架部分，注意不要损伤内膜组织。血管标本常规乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，并制成5μm厚切片，65℃烤片过夜。石蜡切片常规脱蜡至水后，3%H2O2中浸泡8 min以消除内源性过氧化物酶活性，枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）中微波炉加热10 min行抗原热修复，缓慢冷却至室温，PBS清洗2次，5% BSA封闭液室温20 min以封闭非特异性抗原，滴加1∶200稀释的β-tublin一抗，37℃孵育1 h，PBS清洗2 min，连续3次，后滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min，PBS冲洗2 min，连续3次，再滴加SABC，37℃孵育20min，PBS清洗5min，连续4次，最后DAB显色5 min，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。镜下细胞膜显示为棕黄色为阳性细胞，并用Image Pro-Plus（IPP）软件统计阳性细胞所占比率。

1.3 统计学方法

采用SPSS11.0软件进行统计学分析，组间比较采用T检验。所有指标用均数±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

4周中实验动物全部存活至终点，无不良事件发生。

2.1 靶血管形态学变化

对各组标本行Masson大体染色发现，Mustang裸支架植入伴不同球囊扩张后4周，PTA组内膜增生及管腔狭窄均较明显，考虑为支架植入术后的再狭窄效应。与PTA组比较，DEB组内膜增生及管腔狭窄率明显下降；管壁炎性反应评分方面，各组之间炎性反应评分趋向一致（图1，表1）。

图1 裸支架植入伴不同球囊扩张后4周血管标本Masson大体染色结果

表1 不同球囊处理组各种测量值比较

2.2 β-微管蛋白（β-tublin）检测

对各组血管标本行紫杉醇作用靶点β-微管蛋白（β-tublin）免疫组化检测，结果发现，与PTA组相比较，DEB组血管内膜β-tublin表达量显著增加，提示紫杉醇经球囊扩张后有效潴留于血管内膜并发挥生物学作用（图2）。

图2 裸支架植入伴不同球囊扩张后4周血管壁β-微管蛋白（β-tublin）免疫组化检测结果

3 讨论

DEB治疗动脉狭窄性病变的作用机制类似于药物涂层支架，都是通过携带药物抑制内膜增生。目前最常用的药物是紫杉醇，可通过抑制微管蛋白聚集，阻断细胞有丝分裂过程，从而达到抑制细胞增生的作用［6-7］。传统观念认为，动脉狭窄性病变是一个慢性过程，必须通过局部药物的持续性释放方可有效预防再狭窄。然而，后续体外实验显示，将加入亲脂性紫杉醇的对比剂与培养的血管平滑肌细胞进行共孵育，即使短暂的3 min培养即可完全抑制血管平滑肌增生，并且时间可达2周［8］。随后的动物实验也发现，术中使用加入紫杉醇的对比剂以及紫杉醇包被球囊（扩张1 min），即可使得血管壁中紫杉醇的浓度达到抗细胞增殖的浓度（使超过90%药物进入血流），从而显著降低再狭窄的发生，这种效果甚至好于药物涂层支架，这可能是由于支架本身的结构即可造成血管损伤反应，而球囊表面的光滑既避免了操作本身带来的损伤，又保证了药物平稳均匀释放和接触［9］。

正是基于上述研究结果，关于DEB的研发得到了长足的发展。DEB治疗PAD亦是基于以下理论：①脂溶性的紫杉醇能迅速被血管组织摄取达到血药浓度，抗增殖药物的持续释放对抑制再狭窄的炎性反应进程来说并非必要，可减少血栓形成［10］；②药物短期暴露即可明显阻断早期的增生启动因子；③紫杉醇涂层球囊采用了特殊的载体——对比剂溶液或尿素或纳米技术，避免了药物涂层支架表面的聚合物载体（polymer）对内皮细胞修复和愈合过程的抑制，起到抑制血管平滑肌细胞增殖而促进内皮细胞修复的功能。本研究显示DEB处理组血管壁上β-微管蛋白表达量显著增高，再次说明DEB可通过其携带药物紫杉醇达到抑制血管内膜增生的作用。

国外关于DEB的临床研究显示，DEB在治疗小动脉（血管直径为2～8 mm或更小）狭窄时，其术后再狭窄发生率为5.5%，显著低于裸球囊治疗的31%的血管再狭窄发生率［11-12］。更深入的研究显示，DEB可减少血管壁细胞的生长，裸球囊治疗的血管增生厚度为0.3～0.75 mm，而DEB治疗的血管增生厚度为0.2 mm或更少，血管增生厚度的降低最终导致主要不良血管事件的发生率减少［6］。2009年1月Invatec公司的外周球囊新产品IN.PACT Amphirion紫杉醇洗脱球囊导管在欧洲批准上市，其是首个专用于治疗膝部以下（BTK）动脉粥样硬化的DEB。

目前国内尚无治疗PAD的DEB产品问世。本研究依托微创医疗（上海）器械有限公司成熟的生产与研发体系，自主开发治疗PAD的DEB系统。本次动物研究初步显示该新型DEB对PAD具有较好的治疗作用，但尚需临床实验为其提供更多的科学依据。

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The inhibition effect of novel drug-eluting balloon on obstructive peripheral arterial disease of lower extrem ity：an experimental study in rabbitmodels

ZHANGWen-li，DU Run，ZHU Zheng-bin，ZHU Jin-zhou，YING Chen，LIU Hui-zhu，ZHANG Rui-yan.Department of Cardiology，Affiliated Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University，Shanghai200025，China

ZHANG Rui-yan，E-mail：zhangruiyan@263.net

ObjectiveTo investigate the possible inhibition effect of a domestic novel drug-eluting balloon（DEB），such as controlling the vascular stenosis and reducing the intimal hyperplasia，on obstructive peripheral arterial disease（PAD）of lower extremity.M ethods Male New Zealand rabbits（weighted 2.5-3.0 kg）were used for this study.Mustang baremetal stents（BMS）were separately implanted at both the proximal and distal site of abdominal aorta to establish the PADmodels in rabbits.Bare balloon（PTA group）or drug-eluting balloon（DEB group）was separately used to dilate the stent segment of the aorta.The animals were sacrificed 28 days after the treatment.The aorta stent specimenswere collected and sent for pathologic examination.Using Masson staining method the degree of intimal hyperplasia was estimated and the expression level of paclitaxel-targetedβ-tubulin was determined with immunohistochemical method.The results were compared between the two groups.Results Morphologically，both the degree of intimal hyperplasia and the vascular stenosis rate in DEB group were significantly lower than those in PTA group.Meanwhile，immunohistochemical examination of paclitaxel-targetedβ-tubulin indicated that its expression level in DEB group was obviously higher than that in PTA group.Conclusion This experimental study indicates that the domestic novel DEB has potential inhibition effect in respectof controlling the loss of lumen as well as reducing the intimal hyperplasia.This novel DEB carries excellent property，suggesting the possibility to use DEB in clinical treatment of PAD.（J Intervent Radiol，2014，23：423-426）

obstructive arterial disease of lower extremity；drug-eluting balloon；paclitaxel；intimal hyperplasia

R543.5

B

1008-794X（2014）-05-0423-04

2013-09-15）

（本文编辑：侯虹鲁）

10.3969／j.issn.1008-794X.2014.05.014

200025上海交通大学医学院附属瑞金医院心内科通信作者：张瑞岩E-mail：zhangruiyan@263.net