基于视觉模型的苏木精—伊红染色法染色病理切片骨小梁提取

叶含笑， 金红婷， 袁 昕， 江依法

（1.浙江中医药大学，浙江杭州 310053； 2.浙江大学，浙江杭州 310013）

基于视觉模型的苏木精—伊红染色法染色病理切片骨小梁提取

叶含笑1， 金红婷1， 袁 昕2， 江依法1

（1.浙江中医药大学，浙江杭州 310053； 2.浙江大学，浙江杭州 310013）

为了提取HE染色骨组织切片的骨小梁，实现骨小梁面积定量检测，以极坐标扩散方式创建视觉模型，划分骨小梁与骨细胞、骨皮质的边界。提取背景某一像素的RGB值，把病理切片所有像素的RGB值对背景像素求取三维欧式距离，获得阈值，对图像二值化分割，通过区域填充获得骨小梁。结果表明视觉模型能较好地获得感兴趣区域的边界，计量的骨小梁面积精度高于常规软件，检测结果鲁棒性相对于常规软件提高了95%以上，人机交互少，降低了检测的盲目性，提高了检测速度。

计量学；骨组织形态；苏木精—伊红染色法；视觉模型；RGB颜色模型；欧氏距离；图像分割

1 引 言

骨组织形态计量学被广泛应用于代谢性骨病发生发展机制、抗骨质疏松症药物等研究［1］，能较全面、准确地反映骨的新陈代谢过程［2］，但骨组织形态定量检测始终没有统一的标准，究其原因目标区域的选择和提取是定量检测需要解决的难题。一些文献［3～5］和教科书［6］对骨组织形态计量学测量方法归纳为显微镜目镜网格测微尺测定、电脑自动分析系统测定或根据脂肪细胞与造血组织所占面积或容量（volume）凭经验测定。三角测量法［7］（triangulation，TRI）是定量分析骨小梁的方法之一，但测量精度较低；其次是平均截距长度法［8］（Mean Intercept Length，MIL），该方法可以计算测试线在感兴趣区域（Region of Interest，ROI）内部的截距长度，但人机交互繁琐。具有代表性的半自动或全自动骨组织形态计量学分析系统有OsteoMeasure（OM）［9］，BioquantOsteoⅡ［10］等，近年来的文献报道［11］多用Image professional plus（IPP）软件，通用软件需要解决以下一些问题：如何告诉计算机，哪些是骨小梁及感兴趣区域，哪些是骨小梁连接点，哪些又是骨小梁游离末端等，但灵敏度和稳定性等往往不尽如人意。在轮廓识别和提取中，吴凤和［12］提出了计算机视觉测量方法，在特定领域起到了较好效果。本文在骨组织切片ROI获取中模拟人类视觉对色调、明暗、饱和度等辨别能力，采用多特征方法成功获取了HE染色后的骨小梁。

2 算法分析

骨小梁是骨皮质在松质骨内的延伸部分，即骨小梁与骨皮质相连接，在骨髓腔中呈不规则立体网状结构，如丝瓜络样或海绵状，起支持造血组织的作用，正常情况下，骨小梁具有一定的长度，它们之间有一定距离。苏木精—伊红染色法（hematoxylineosin staining），简称HE染色法，苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。图1和图2为HE染色后的小鼠脊椎病理切片。

图1 小鼠脊柱HE染色病理切片1

图2 小鼠脊柱HE染色病理切片2

图1为骨皮质内骨小梁和骨细胞的一部分，图2包括肌肉组织、骨皮质、骨小梁和骨细胞。观察图1和图2的骨小梁和骨细胞、骨小梁和骨皮质，具有明显的颜色差异，从肉眼观察，骨小梁与其他组织之间边界非常明显，骨小梁和骨细胞之间隔着白色带并且有深色杂质相连；骨小梁和皮质之间颜色界限分明，从人类视觉上瞬间就能界定骨小梁的区域，但却无法量化计算出骨小梁的面积，让计算机识别骨小梁是获得骨小梁量化指标的前提条件。

病理切片骨小梁与骨细胞内核及肌肉组织在色彩和颜色深度上有重复，但骨细胞与骨小梁之间有比较明显的白色带边界，白色边界不连续部分，色块成粗粒状，颜色较深。视觉对图1所示骨小梁的判断可通过骨细胞形状、并结合骨小梁边界完成，因此可通过颜色梯度，形状的延续性和相似性创建数学模型来模拟人类视觉功能。以病理切片相同组织的颜色相似性和形状的连续性将边界模糊的地方区分开来，然后填充区域，获得ROI，图2骨组织切片的组织结构相对完整，包含了骨皮质与肌肉组织，而骨皮质与骨小梁交界处颜色梯度明显，将骨皮质与骨小梁分割后与肌肉组织形成封闭的白色带以后，也可以通过区域填充获得ROI。

3 视觉模型

模拟人类通过骨小梁上的点扩散到骨小梁边界来获得骨小梁区域的方法，根据点到面的扩散原理创建视觉模型，对HE染色病理切片骨小梁区域的进行提取，具体方法为参考人类视觉从感兴趣区域点到面的扩散过程，创建基于极坐标方程的扩散模型，模拟人类对颜色梯度的感知以及边界形状的相连相似的性质，确定骨皮质和骨小梁色带边界上的点，以像素作为极坐标单位长度，以色带边界上的点为中心，调整网格数量M和N，M为极坐标单位长度，N表示极坐标单位角度倍数，两者都以像素为单位，通过对N角度大小的判断及M长度内像素颜色深度阈值来求得色带边界，划分骨小梁区域，并以此获得边界上被删除区域S（ri，θj），极坐标模型描述如下。

设R是骨小梁与细胞边界点组合的区域（色带边界），P＝｛（x，y）|（x，y）∈R｝，设区域R的几何中心坐标为R（xc，yc），则得到集合P（x，y）的“极坐标”表示为（r，θ）相应的变换公式如下：

式中，r为任意点P（x，y）到几何中心R（xc，yc）的矩离，它描述了各点对几何中心点的径向分布，表示区域R对其几何中心的展开程度；θ描述了该区域的角向分布，表示其在某一角度范围内的分布情况。设集合P中几何中心点最远点为rmax，其与几何中心点的距离为

如果将径向分成M（M为正整数）等份，将角向均分成N（N为正整数）等份，则径向dr（r代表极径）与角向da（a代表极角）的间隔分别为

于是，区域P（色带边缘）被划分成一系列网格区域（共M×N个），而网格S（ri，θj）则可以表示为

判断区域S（ri，θj）内像素颜色深度的阈值，调整M和N的大小，在S（ri，θj）区域内满足颜色像素密度或颜色深度低于给定的阈值时即填充为白色，将骨小梁与骨细胞和骨皮质边界分割开。效果如图3和图4所示。

图3 获得边缘图像1

至此，计算机获得了骨小梁和其他肌肉组织的边界，通过二值化图像分割，以及区域填充得到骨小梁病理切片。

图4 获得边缘图像1

两点间欧式距离的数学模型及属性如下所示：

设ξ，η∈V，将|ξ－η|称为ξ与η间的距离，记为d（ξ，η），即

根据以上欧式距离的属性，以x1代表骨组织切片任意点的像素RGB颜色模型中的R值，y1代表任意点像素的G值，z1代表任意点像素的B值。x2，y2，z2分别代表背景像素的RGB值。

由上所述任意点像素与背景像素点RGB颜色之间的欧式距离可以用算术表达为：

通过颜色欧式距离计算，在d大于最后一个像素与背景颜色的欧式距离的情况下，颜色取值为1，其他为0，假如背景颜色不均匀可适当调整不等号右边的值，d为二值化最优自适应调整参数。并对二值化分割后的图像进行区域填充。由于骨小梁染色不均匀等原因，骨组织切片显微图像上的骨小梁会出现针尖样的空隙，这些空隙被称为噪声，对填充后的图像进行先膨胀后腐蚀的操作，即可去除噪声。先膨胀后腐蚀的过程称为闭运算。它具有填充物体内细小空洞，连接断开的邻近目标，平滑边界的同时通过闭运算并不明显改变ROI面积。图5和图6为处理完成的骨小梁二值化图像。

在图5和图6基础上，很容易就能获得骨小梁计量学上的二维分量如骨小梁面积，通过公式运算获得骨小梁密度等其他组织形态计量学指标。为了对比算法的稳定性，对50张骨组织切片进行了相同的操作，发现其稳定性、精度和计算的速度均高于常规使用的软件。图7为狗骨组织切片染色后的效果，图8为提取到骨小梁的骨组织切片。

图5 分割后获得骨小梁1

图6 分割后获得骨小梁2

图7 对照小组原图像

4 检测结果对比

图8 分割效果

相对于通用的常规软件Osteo Measure（OM），Bioquant OsteoⅡ及IPP基于视觉模型的图像分割方法准确度和运算速度都有显著提高。IPP软件目标区域的选择最有用处的工具有两个。一个就是segmentation工具，另一个是irregular工具。segmentation工具通过对目标区域的颜色来实现AOI的提取，而HE染色病理切片中骨小梁、骨细胞、骨皮质乃至肌肉组织都交叉混淆有相同颜色的像素，因此在AOI提取上segmentation工具会把各组织相同颜色像素混淆在一起。irregular工具是用来描绘不规则孤立对象边界的工具。观察病理切片，骨小梁与骨皮质及骨细胞边界大量粘连，直接用irregular工具描绘骨小梁边界工作量巨大，在边界中有很多不同组织的相连像素颜色值一致，无法用自带的AUTO工具来选择边界。因此也不是最优选择。IPP软件对图1和图2中AOI的提取效果和精度都达不到后续测量的要求。为此用IPP对感兴趣区域相对清晰的图7进行了IPP的操作，segmentation工具提取的骨小梁如图9所示。

图9 黑色部分为骨小梁区域

本次对照测试样例的检测由5位经验丰富的骨组织形态计量学检测专家完成，检测对象为图7所示病理切片，通过视觉模型分割的骨小梁面积检测和IPP软件、浙江省骨伤研究所购买的骨组织形态计量学分析设备和OM骨形态计量系统计算获得骨小梁面积检测对照如表1所示。

采用IPP软件和OM骨形态计量系统由不同检测员检测的骨小梁面积各不相同，由此可见常规软件对骨组织感兴趣区域的选择具有主观判断依赖性，其结果的稳定性受检测员经验影响较大。而视觉模型检测软件由于感兴趣区域ROI划分标准一致，因此获得的结果统一，5位检测员采用IPP软件获得的骨小梁面积平均后得到的值为1 935 363像素，OM检测软件获得的骨小梁平均面积值为1 935 406，与视觉模型获得的检测结果1 935 379分别相差16像素和27像素，基于视觉模型的检测软件获得的结果非常接近于多名成员通过常规软件检测的平均值，可见该模型获得的骨小梁面积不仅结果稳定，而且检测值具有较好的统计学意义。

表1 骨小梁面积检测结果对照表像素

5 讨 论

模拟人类视觉扫描方式，创建多特征融合视觉模型获得的检测结果稳定性远高于常规检测软件，视觉模型获得的骨小梁面积更接近于通用软件多人次检测后的平均值。由此可见参考人类视觉对图像感兴趣区域的获取方法，把目标区域的几何形状、颜色梯度、边缘曲度多特征融合，并由此创建视觉扫描模型将会使感兴趣区域获取更具鲁棒性和准确性，在图像识别的普适性上也会表现出越来越明显的优势。

［1］ 李建赤，黄必留，徐自强.骨组织形态计量学在临床骨病应用中的研究与进展［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，（3）：6607－6610.

［2］ 付鑫，马剑雄，董宝康，马信龙.骨微结构检测方法研究进展［J］.中国骨与关节外科，2009，（6）：509－514.

［3］ 曹立，雍宜民.老年股骨颈骨折患者骨密度、骨形态计量学的研究［J］.中华创伤杂志，2000，（8）：488－491.

［4］ 邱明才，杨宝恩，王觉英，等.正常国人髂骨形态计量参数的研究［J］.中华医学杂志，1990，（12）：685.

［5］ 郭昭庆，党耕町，王志国，等.正常人髂嵴活检标本的骨组织形态计量学分析［J］.中华骨科杂志，1995，（4）：228－230.

［6］ 邱明才，戴晨琳，李玉坤，等.代谢性骨病学［M］.北京：人民卫生出版社，2012：436－438.

［7］ Quest D，Gayer C，Hering P.Depth measurements of drilled holes in bone by laser triangulation for the field of oral implantology［J］.Journal of Applied Physics，2012，111（1）：013106.

［8］ Gundersen H J G，et al.Distribution of membrane thickness determined by lineal analysis［J］.Journal of Microscopy，1978，113（1）：27－43.

［9］ Osteo Measure TM software［OL］.http：／／www. osteometrics.com／product_info.htm，2012-09-20.

［10］ Bioquant OsteoⅡsoftware［OL］.http：／／osteo. bioquant.com／home，2012-08-02.

［11］ Droke E，Hager K，Lerner M，et al.Soy isoflavones avert chronic inflammation－induced bone loss and vascular disease［J］.Journal of Inflammation，2007，（4）：17.

［12］ 吴凤和.基于计算机视觉测量技术的图像轮廓提取方法研究［J］.计量学报，2007，28（1）：18－22.

Extract Bone Trabecular of Hematoxylin-eosin Staining Dyeing Pathological Section by VisualModel

YE Han-xiao1， JIN Hong-ting1， YUAN Xin2， JIANG Yi-fa1
（1.Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou，Zhejiang 310053，China；
2.Zhjiang University，Hangzhou，Zhejiang 310013，China）

To extract trabecular bone of hematoxylin-eosin staining staining bone tissue pathological slices，for quantitative detection of trabecular bone area，create a polar diffusion model，to let computer extract any hematoxylin-eosin staining dyeing bone slice trabecular bone，divide the boundary of the trabecular bone with bone cells and bone cortex. Extract a pixel's RGB values of background，use RGB color value of all pixels with the background pixels to calculate 3d euclidean distance，get threshold，to achieve image binarization segmentation，by area filling get trabecular bone.Results show that the visual model can get the boundary of the region of interest well.Measurement accuracy and speed are significantly improved.Results of measurement relative to the conventional software the robustness improve over 95%，reduce human-computer interaction，to reduce the blindness of testing.

Metrology；Bone tissue morphology；Hematoxylin-eosin staining；Visual model；RGB color model；Euclidean distance；Image segmentation

TB99

A

1000-1158（2014）03-0291-05

10．3969／j．issn．1000-1158．2014．03．20

2012-10-11；

2013-04-01

2013年浙江省教育厅计划（FX2013047）；浙江省钱江人才计划（QJD0802007）

叶含笑（1974－），女，浙江东阳人，浙江中医药大学副教授，主要从事图像处理、骨组织形态计量学研究。yhx＠zcmu.edu.cn