猪口蹄疫O型缅甸98系毒株对乳鼠的适应性研究

王莉君 刘 宏

(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐 830000；2.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司,新疆乌鲁木齐 830000)

猪口蹄疫O型缅甸98系毒株对乳鼠的适应性研究

王莉君1刘 宏2

(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐 830000；2.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司,新疆乌鲁木齐 830000)

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的猪、牛、羊等偶蹄动物的一种烈性传染病，给流行国家和地区带来严重的经济损失，筛选与田间流行毒株基因型相近的、免疫原性良好的、适合生产特性的制造疫苗毒株，将对疫情的有效控制会起到非常重要的作用。

本论文针对中国农业科学院国家口蹄疫参考实验室分离鉴定的四株东南亚拓扑型缅甸98系O型口蹄疫乳鼠毒，在乳鼠上进行传代，对各毒株的收毒时间和最终代次的毒价进行比较，并根据结果选择对乳鼠适应性最好的一株，作为检验用毒株，并为生产用毒株的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

四株东南亚拓扑型缅甸98系O型口蹄疫乳鼠毒，分别为O/ GD/10-8株、O/GD/10-9株、O/GX/10-10株、O/XJ/10-11株；2～3日龄昆明系乳鼠带母鼠饲养；磷酸盐缓冲溶液（PBS）；50%甘油-磷酸盐缓冲液；石英砂购自天津盛奥精细化工公司；高速低温离心机；冷藏冷冻两用冰箱；眼科手术剪、镊；注射器；移液器；陶瓷研钵。

1.2 方法

1.2.1 磨毒传代

分别将四支O型口蹄疫乳鼠毒称重，取约1g加入灭菌后的研钵，再加入适量灭菌石英砂充分研磨，期间加入适量PBS，使之完全研磨成匀浆，最终制成1：10的组织悬液，放在2～8℃的冰箱中，浸毒16～20h。浸毒结束后，使用低温离心机，在4℃左右以3000r/min离心20mn，吸取上清液，于颈背部皮下接种2～3日龄的乳鼠8～12只，每只乳鼠的注射量为0.1ml。接种后观察，并收取发病典型的濒死乳鼠或死亡乳鼠，将乳鼠用1：50新洁尔灭清洗两遍，再用PBS清洗两遍后，剪去头、四肢、尾，剪开胸腔和腹腔，剔除内脏，剥去皮和皮下脂肪，用50%甘油-磷酸盐缓冲液保存。此胴体即为第一代乳鼠毒（MF1）。按上述方法，继续称重、研磨，即可进行下一代乳鼠毒的传代工作。

1.2.2 LD50测定

将所取毒样混合均匀，抽取毒样0.2ml，沿管壁缓慢注入盛有1.8ml稀释液的离心管中。加样时吸头尖不得接触稀释液液面，并重复吹两次，尽量减少吸头内壁残留液体，然后将管内液体混匀，更换吸头准备进行下一步稀释。以此方法作10倍系列稀释，期间每个滴度换一支吸头，取10-5，10-6，10-7，10-8等各稀释度，每稀释度颈背部皮下接种2～3日龄的乳鼠4～5只，每只注射0.2ml，各稀释度分别作标记。将乳鼠置于23～26℃室温环境下，带母鼠饲养。每日观察1～2次，记录每次观察时发病、死亡的乳鼠只数。于注射后24h之前死亡乳鼠不计数。连续观察4～7日，根据发病死亡乳鼠数，按照Reed-Muench法计算LD50。

2 结果与分析

在乳鼠传代过程中，四株毒的收毒时间和最终代次的LD50如下表所示：

由上表可知，毒价方面，四株毒种在传至MF5代时，O/ GD/10-8株最高，O/GD/10-9株、O/XJ/10-11株次之，O/GX/10-10株相对略低。病毒收毒时间方面，O/GD/10-8株在MF3和MF4两代中，发病、死亡时间出现反复，而且波动较大，在MF5代收毒时，发病后死亡时间拖延至9.5h（12.5h～22h收）；O/GD/10-9株同O/GD/10-8株相似，在MF3和MF4两代中，发病、死亡时间出现反复，在MF5代收毒时，发病后死亡时间略有延长，拖延至7.5h（17h～24.5h收）；O/GX/10-10株也是在MF3和MF4两代中，发病、死亡时间出现反复，但在MF5代收毒时，发病后死亡时间为4.5h（15h～19.5h收）；O/XJ/10-11株从MF1代至MF5代，发病、死亡时间一直呈逐步缩短的状态，在MF5代收毒时，发病后死亡时间为2h（17.5h～19.5h收）。

综合毒价高低和收毒时间长短，在对乳鼠的适应性方面，选择了收毒时间相对稳定、毒价比较高的O/XJ/10-11株继续进行了传代，传至MF7代时，收毒时间趋于稳定（15h～18h），测得LD50为10-8.0/0.2ml。

3 讨论与结论

四株口蹄疫毒种在传代过程中，能较快的适应乳鼠，并且乳鼠的发病、死亡时间基本呈现逐渐缩短、集中的趋势，但在细节上略有区别。毒价方面，四株毒种MF5代的毒价差异不大，LD50均不低于10-7.5/0.2ml。综合毒价和收毒时间两方面因素考虑，在对乳鼠的适应性方面，选择了收毒时间相对稳定、毒价比较高的O/XJ/10-11株继续进行传代，传至MF7代，收毒时间趋于稳定（15h～18h），MF7代测得LD50为10-8.0/0.2ml。本研究结果显示，四株待选毒株中，O/XJ/10-11株对乳鼠的适应性最好，致病性强，传代过程稳定，收毒时间短，可作检验用毒株使用。

表2 -1 四株口蹄疫种毒鼠毒收毒时间和最终代次的LD50