检测鸡痘病毒抗体间接ELISA方法的建立

黄卓文

(广州市高级技工学校,广东广州 510420)

检测鸡痘病毒抗体间接ELISA方法的建立

黄卓文

(广州市高级技工学校,广东广州 510420)

应用鸡胚成纤维细胞(CEF)扩增鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)并提纯后作为抗原建立了具有较高特异性和灵敏性的间接ELISA方法。通过方阵滴定法来确定抗原最佳稀释倍数为1：1600,待检血清最佳稀释倍数为1∶100。并检测50份FPV免疫实验鸡血清用本方法进行检测,其阳性检出率为84%(42/50)。

间接ELISA；鸡痘病毒；抗体

鸡痘是由FPV引起的鸡的一种接触性传染病。本病分布于世界各地，特别是大型鸡场中更易流行，可使鸡生长迟缓、消瘦、产蛋量下降。若并发其它传染病、寄生虫病和卫生条件、营养状况不良时，可引起大批死亡，尤其对雏鸡造成更严重的损失，使用疫苗进行免疫预防是控制本病的重要措施[1]。

检测鸡血清中鸡痘抗体，可以了解疫苗免疫状况和机体感染情况。另外，FPV被越来越多用做载体构建基因工程疫苗，用于动物的免疫预防，所以，通过抗体的检测还可以间接评价重组鸡痘病毒对试验动物的免疫状态。鸡痘病毒抗体的血清学检测方法主要有免疫扩散试验、被动血凝试验、中和试验、荧光抗体技术和ELISA等[1～3]。对于比较常用的免疫扩散试验，由于沉淀抗体仅能在感染后的较短时间内测出，所以采血时间不当会影响检测结果。然而ELISA具有特异、灵敏、稳定、快速等优点，被越来越多地用于鸡痘病毒抗体的检测[4]。

1 材料和方法

1.1 病毒和血清

FPV282E4株，鸡痘阳性血清为使用市场疫苗免疫SPF鸡制备，阴性血清为1日龄SPF鸡血清，待检血清日常检测样品，新城疫、禽流感阳性血清为使用市场新城疫疫苗、禽流感单价疫苗免疫SPF鸡制备。

1.2 其他材料

邻苯二胺（OPD）、羊抗鸡IgG-HRP，犊牛血清，96孔酶标板，SPF鸡胚等。

1.3 抗原的扩增及提纯

取9～10日龄SPF鸡胚按常规方法制作CEF，长成单层后接种FPV，病变达80 %以上时收获细胞；4℃2 000 r/min离心20min，沉淀重悬于PBS中；超声波（60 W）裂解8个循环，每次15 s，冰浴45 s，36 %（W/V）蔗糖垫底，4℃15 000 r/min离心120 min，沉淀经超声波再次裂解4个循环；置20 %～50 %（W/V）蔗糖梯度上，4℃15 000 r/min离心90min，小心吸取病毒带，0.1 %的甲醛灭活后保存备用。

1.4 间接ELISA试验最佳条件选择

1.4.1 抗原包被和待检血清最佳稀释倍数的测定

以pH9.6的碳酸盐缓冲液将抗原1∶100倍比稀释至1∶12800，4℃24 h包被；然后用含0.05 %吐温80的0.05mol/LPBS（简称PBST，pH为7.2）洗5 min×3次，加入含10 %犊牛血清（FCS）的PBS，150μl/孔，37℃1 h封闭；PBST洗5 min×3次，将阳性血清分别1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀释，100μl/孔，37℃2 h进行方阵试验；再用PBST洗5min×3次，每孔加1∶10 000稀释的酶标抗体100μl/孔，37℃2 h；PBST洗5 min×3次，加入OPD底物溶液100μl/孔，37℃10 min；用2 M的H2SO450μl/孔进行终止后酶标仪OD490读数，每个稀释度重复一次，取其平均值。

1.4.2 酶标抗体工作浓度的选择

待检血清按1.4. 2确定的时间作用后，将酶标抗体分1∶10 000、1∶15 000和1∶20 000稀释，100μl/孔，其它步骤同1.4.2相同。

1.4.3 底物最佳显色时间的选择

酶标抗体作用、洗涤、加入底物后，37℃分别作用5 min、10min、15min，用2M的H2SO450μl/孔终止后读数。

2 结果

2.1 抗原包被和待检血清最适稀释倍数的测定

方阵试验如表1所示，随着抗原、血清稀释倍数的增大，其OD值逐步减小。抗原稀释倍数的逐渐变大，阳性、阴性血清的OD值逐渐降低，但P/N值逐渐变大。随着抗原稀释倍数的继续增大，由于阳性OD值变化加快，而阴性OD值变化不太明显，P/N值又逐渐变小。当抗原以1∶1 600、待检血清以1∶100稀释时，OD值为0.997，约等于1，阴性OD值为0.067，远小于0.1，P/N值最大为13.9；同时，确定抗原1∶1600稀释，待检血清1：100稀释。

2.2 酶标抗体稀释浓度的选择

当酶标抗体1∶15 000稀释时，阳性OD值稍微降低，但P/N值最高，所以酶标抗体最佳工作浓度为1∶15 000。

2.3 显色时间的选择

当显色时间10 min时，P/N最高，当显色时间为15 min时，OD值升高，但阴性值升高，P/N反而降低，所以显色时间以10 min为佳。

2.4 特异性试验

间接ELISA检测结果显示本抗原与其它几种血清无交叉反应。

2.5 临床样品检测

对50份鸡血清检测结果如表1所示，随着免疫后日龄增加，其阳性率逐渐升高，阳性率在免疫后18 d最高，达到100 %，样品总阳性率为82%。

表1 临床血清样品的间接ELISA检测

3 讨论

Buscaglia和Tripath等用中和试验和间接ELISA同时进行检测，结果中和试验阳性检出率很低，但用ELISA方法却能明显检测出鸡痘抗体的存在，证实了间接ELISA方法的灵敏性，此外，中和试验、荧光抗体免疫技术因稳定性差、操作麻烦及仪器昂贵而难以广泛应用。而ELISA则以其特异、敏感、快速、准确、操作简便的特点，被越来越多地用于鸡痘抗体的检测。在ELISA试验反应中抗原抗体之间的免疫学反应要经过一定时间后才会进行充分，而酶的催化反应与时间关系更大，这样既能避免因反应时间过短而引起的结果误差，又不会因反应过长影响检测的敏感性和特异性，针对情况本试验对每一步反应时间都进行了最佳选择。其最佳反应条件为：抗原最佳稀释度为1：1600，37℃1 h进行包被，用含有10 % FCS的PBS 37℃3h进行封闭；待检血清1∶100稀释，37℃作用1.5 h；酶标抗体1∶15 000稀释，37℃作用1h；显色为37℃10min。虽然间接ELISA具有以上优点，但它对条件要求高，其中病毒的增殖和抗原的纯化是其中最为关键的步骤。

[1] Sawata A，KKume Y.Nakase.Hemagglutinin ofHaemophilus para-gallinarum serotype 2 organisms：Occurrence and immunologicproperties of hemaglutinin[J].American Journal of Veterinary Re-search，2004，（43）：1311-1314.

[2] 徐春厚，孙力，于春生，等.用ELISA检测鸡痘病毒抗体的研究[J].中国畜禽传染病，2006，（4）：33-35.

[3] 蒋成侏.酶免疫测定法[M].北京：人民卫生出版社，1984：102-132.

黄卓文（1982-），男，工作单位：广州市高级技工学校，兽医助理讲师，学士，研究方向：动物医学。