猪圆环病毒1型阴性PK-15细胞的单细胞克隆与鉴定

刘 宏王莉君

(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐 830000；

2.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司,新疆乌鲁木齐 830000)

猪圆环病毒1型阴性PK-15细胞的单细胞克隆与鉴定

刘 宏1王莉君2

(1.新疆农业大学动物医学学院,新疆乌鲁木齐 830000；

2.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司,新疆乌鲁木齐 830000)

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）属圆环病毒科圆环病毒属，是目前为止已知的最小的动物病毒之一。根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，可将PCV分为PCV-1及PCV-2两个型。PCV1为非致病性的病毒，由德国学者Tischer于1974年从多株连续传代的PK-15细胞中最先发现。PCV2为致病性的病毒，来源于制备PK-15细胞的猪肾组织。猪圆环病毒对外界的抵抗力较强，对氯仿不敏感，不凝集猪、牛、羊、鸡等动物和人的红细胞。研究表明，该病毒可在RK-15细胞上生长，但不引起细胞病变，可在细胞浆内发现较多包涵体，少数感染的细胞还可能内含有核内包涵体。PCV不能在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21细胞上生长。

调查表明，PK-15细胞在被ATCC收藏后不久即检测出PCV1，然而确切的污染来源目前尚未查清，很有可能最初的猪肾细胞PK-2a就存在PCV1，或是其他的细胞培养物污染导致。所以，国内细胞供给实验室的PK-15细胞均有不同程度的PCV1污染。虽然PCV1无致病性，但由于其的存在会与PCV2发生相互污染，影响PCV2的传代增殖，而且不利于PCV2疫苗研发及抗体检测。综上，有必要筛选出一株无PCV1污染的PK-15细胞。

本研究拟采用有限稀释法筛选单细胞进行克隆，并经PCR检测，逐步筛选出一株猪圆环病毒1型阴性的PK-15细胞，用于PCV2的分离与传代培养研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 无支原体胎牛血清、DMEM培养基和胰蛋白酶均购自Hyclone公司公司产品；细胞培养板（nunce）、Taq DNA Polymerase、dNTP Mix、DL2000 DNA Marker、FITC-兔抗猪IgG（二抗）、氨苄青霉素、链霉素均购自宝信生物技术有限公司。PCV2阳性血清（一抗）购于武汉科前生物技术股份有限公司。

1.1.2 细胞株 PK-15细胞，购于武汉细胞培养中心。

1.1.3 引物 由于PK-15细胞起源于猪，因此细胞中存在多种猪源病毒污染。以下病毒的引物设计参见文献[16]。引物序列具体如下：

引物名称引物序列片段大小(bp) PCV1P1 5’-CAACTGCTGTCCCAGCTGTAG-3’1252bp P2 5’-TTCTTTATTCTGCTGGTCGG-3’1168bp P3 5’-GGTACCCGAAGGCCGATTTG-3’PCV2上游 5’-AAGGGCTGGGTTATGGTATG-3’353bp下游 5’-CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3’PPV上游 5’-AGGCTAACGCATGGGGAGT-3’582bp下游 5’-TGTTCCTGGGTGTTGGTCTC-3’PRV上游 5’-AGTACTCGCAGGGGCGCAACT-3’372bp下游 5’-GCCGATCTTGGTGTAGGTGT-3’CSFV上游 5’-CATTTCTTTATAGGCTCATC-3’173bp下游 5’-CTGTGGCTAATAGTGACCTAC-3’

以上引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PK-15细胞单克隆

将PK-15细胞培养于细胞瓶形成细胞单层，用0.25%胰酶-EDTA消化，加入适量DMEM生长液（含2%犊牛血清和1%双抗）吹打，分散细胞成单个，加入DMEM生长液（含10%犊牛血清和1%双抗），做10倍梯度稀释至大约20个细胞/ml，取100μl铺于96孔板中，即2个细胞/孔。左右、上下摇晃后放置于37℃、5%CO2培养箱培养12h，次日镜下观察孔内细胞，单个细胞的孔做好标记。培养7～10d后，长成单细胞克隆时，用胰酶将其消化下来，再次稀释成单个细胞，做进一步的亚克隆，方法同上。经两次亚克隆后，挑选出单细胞克隆株进行扩大培养。细胞进行10次传代，每传代一次，进行一次PCV检测。最后，对PCR检测结果为阴性的细胞克隆株命名，并将其冻存备用。

1.2.2 PK-15中PCV1检测

应用半巢式PCR的方法检测PCV，采用25μl PCR反应体系。首先利用P1和P2引物进行第一步PCR扩增，反应条件为：94℃预变性4 min后，按94℃变性45s，64.5℃退火 60s，72℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。然后，利用P2和P3引物进行第二步PCR扩增，以第一次PCR产物作为模板，除退火温度为56℃之外，其他反应条件与第一步PCR相同。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察结果。

1.2.3 PK-15中外源病毒检测

我们对克隆的PK-15细胞进行外源病毒检测。PCR反应体系和反应条件如下：PCR反应体系（25μl/管）：10×PCR Buffer 2.5 μl、2.5mm/l dNTPs 2 μl、DNA模板、上下游引物各0.5 μl、Taq DNA polymerase 0.25 μl、ddH2O 17.25μl。各试剂加完后，吹打均匀，瞬时离心，进行如下反应条件：95℃预变性4 min；94℃变性45 s；（PPV 56.8℃、PRV 58℃、CFSV 55℃）退火45 s；72℃延伸2 min；共35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，观察PCR扩增结果。

2 结果

2.1 PK-15细胞单细胞克隆与PCV1检测

PK-15细胞（含PCV1）经第一次有限稀释法克隆，得到35个克隆。细胞形态良好，轮廓清晰，比克隆前的PK-15细胞在整体上要好（图1）。经半套式PCR检测，27个克隆为PCV1阳性，片段大小为1168 bp，8个克隆为PCV1阴性，没有任何条带（图2-2）。说明PK-15细胞确实受到PCV1的污染。将获得的8株细胞进行两次亚克隆后，最终PCR检测为PCV1阴性的单细胞克隆株命名为PK-15MC。

图1 PK15细胞克隆前与克隆后72 h

另外将第一次PCR检测为PCV1阴性的8个克隆株进行两次亚克隆，并进行扩大化培养10代、20代、30代。每代次的细胞均进行PCR检测，最终获得3个PCV1阴性细胞克隆株，分别命名为PK-15MC1、PK-15MC2、PK-15MC3。

图2 PK-15MC1克隆株的PCV1检测

2.2 PK-15中外源病毒检测

将最终获得的PCV阴性克隆株PK-15MC1、PK-15MC2、PK-15MC3进行外源病毒的检测。PCR鉴定结果如下：

图3 PK-15MC克隆株的PRV、PPV、CSFV检测

3 讨论

因为PCV不表现CPE，并可长期持续污染PK15细胞而不被发现。另外被PCV1污染的PK15细胞，在增殖培养PCV2时会出现病毒增殖速度变慢的现象。这给病毒的分离纯化工作带来极大不便。有研究证实，在快速生长的细胞中会有少数细胞未被PCV1感染，因此可以通过软琼脂法、显微操作法和有限稀释法等多种方法进行单细胞的筛选，获得无PCV存在的PK-15细胞。本研究选用相对简单的有限稀释法对PK-15细胞进行单克隆筛选。

半套式PCR是用第一次PCR扩增产物作为第二次PCR扩增的模板，并且因为第二次PCR反应中的一个引物缩进，会使靶DNA序列得到有效的选择性扩增，大大提高了扩增的特异性和灵敏性。本试验中在第一次克隆得到35个克隆孔中，PCR检测有8个克隆孔为阴性，第二次亚克隆后再进行PCR检测，仅有3个克隆孔为阴性。这种在阴性克隆中又出现PCV1阳性的原因，可能与病毒含量低半套式PCR检测不出来有关。因此，本人将细胞扩大培养后10代、20代、30代，在进行PCV1检测，此时病毒核酸数量远远超过检测PCR下限，有利于检测出病毒核酸来。这样才可以获得稳定的不存在PCV1的PK-15细胞。本研究将获得的3株PCV1阴性的PK-15细胞，传代30代次后进行PCV1、PPV、PRV、CSFV等外源病毒检测，检测结果均为阴性。PK-15阴性细胞的获得为临床分离和鉴定PCV和PCV相关疫苗研制等工作提供了良好的物质保障。