Luminex液相芯片技术在动物医学领域中的应用展望

杨显超 吴秀娟 李凯航 王 建

(上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103)

Luminex液相芯片技术在动物医学领域中的应用展望

杨显超 吴秀娟 李凯航 王 建*

(上海市动物疫病预防控制中心,上海 201103)

液相芯片技术是以100种荧光编码微球做为生物探针的载体,生物分子在悬浮液态体系中进行反应,以流式细胞术做为光学检测手段的一种新型生物芯片技术。它以其易于操作、高通量、高灵敏度、高准确度、高精密度以及宽的线性测定范围等优点,目前已广泛应用于生物医学研究的各个领域,本文就液相芯片技术在动物医学领域中的应用作一展望。

液相芯片；兽医；检测；应用

目前动物疫病和人畜共患病多病原协同感染的临床现象越来越普遍，这给疫病的诊断提出了更高要求，单病原诊断技术已经无法满足临床的需要，高通量、针对有共性的特定病原的鉴别诊断才能保证诊断的可靠性和准确性。特别是在出现类似黄浦江漂浮死猪事件和人感染H7N9禽流感疫情的公共卫生事件和疫苗免疫效果评估时，动物疫控实验室对高通量、高速度、多功能性、灵敏度高、准确性高的多重数据获取和分析平台需求尤为迫切。而液相芯片系统有机地整和了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、信号处理技术等多项技术，具有高通量、高速度、准确性高、重复性好、灵敏度高等优点，既可用于临床流行病诊断、监测、疫苗免疫效果评估，也可用于基因表达、SNP分型、细胞因子检测等科研领域，尤其是对于多种病原的诊断和筛选具有极大优势。该技术获得2005年度国际临床诊断技术革新大奖，代表着生命科学基础研究和医学诊断技术的发展方向，在国际临床诊断技术领域的领军地位得到了最具权威的认可。

1 液相芯片技术的原理

1997年由美国Luminex公司开发出了xMAP的检测技术，标志着液相芯片技术的诞生。液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球（直径5.5～5.6μm）为主要基质构成，每种微球上固定有不同的探针分子，将这些微球悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相芯片系统，利用这个系统可以对同一个样品中的多种不同分子同时进行检测。在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种固定有探针的微球都有一个独特的色彩编号，或称荧光编码。在微球制造过程中掺人了红色和橙色两种荧光染料（这两种染料各有10种不同区分），从而把微球分为100种不同的颜色，形成一个具有独特光谱地址的含有100种不同微球的阵列。不同颜色微球在分类激光激发下产生的荧光互不相同，这种分类荧光是识别不同微球的唯一途径。利用这100种微球，可以分别标记上100种不同的探针分子。检测时先后加人样品和报告分子与标记微球反应，样品中的目的分子（待检测的抗原或抗体、生物素标记的靶核酸片段、酶等）能够与探针和报告分子特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，随后利用仪器（如Luminex100）对微球进行检测和结果分析。仪器采用微流技术使微球快速单列通过检测通道，并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。红色激光可将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型（即定性）；绿色激光可确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量（即定量）。因此，通过红绿双色激光的同时检测，完成对反应的实时、定性和定量分析。

原理图：

2 液相芯片技术的优点

液相芯片技术最突出的优点在于：仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子，即多重检测。具体说来，与现有用于临床诊断的化学发光、电化学化光法及ELISA法相比，液相芯片技术具有以下显著优点。

2.1 高通量

可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行实时、定性、定量分析。从理论上说，如果不存在交叉反应，检测的通量等于微球的种类数，目前最多可达到100种。这与传统方法的逐个检测相比是一个质的飞跃。

2.2 样本用量少

由于在同一个反应孔中可以同时完成100种不同的生物学反应，所以大大节省了样本用量，液相芯片的血清用量较ELISA法、化学发光法、电化学发光法要少得多。

2.3 操作简单、快速

由于是基于液相反应动力学，因此反应速度快，孵育时间比传统的固相检测短。进行免疫学分析时，若使用高亲和力抗体，2～3h内即完成检测，而核酸杂交分析在PCR扩增后lh 内可得到结果。

2.4 灵敏度高

微球表面积大，每个微球上可包被10万个捕获抗体，如此高密度的捕获抗体保证了能够最大程度地与样本中的抗原分子结合，提高检测灵敏度。最低检测浓度可达到0.lp/ml，是ELISA灵敏度的10～100倍。

2.5 检测范围广

可达3-5个数量级（如Bio-Rad公司细胞因子检测试剂盒的检测范围达到可达到0.2～ 32000 pg/ml）。

2.6 特异性强

无需洗涤就能够自行将和微球结合的与未结合的分子区分开来，只读取单个微球上的荧光信号，信噪比好。

2.7 准确性高

微球上的报告分子荧光强度与结合的待测分子成正比。由于液相芯片技术的检测范围大，因此不需要象ELISA检测中那样需将样本多倍稀释，从而减小了误差。

2.8 重复性好

这是由于：与ELISA依靠酶放大作用的比色读数相比，液相芯片技术中的荧光读值更加直接、稳定、灵敏；每种微球检测100个，最终取荧光强度的中值作为结果，这相当于对每个样本重复检测了100次，而ELISA仅为双复孔或三复孔，因此液相芯片检测结果的准确性和重复性是ELISA无法比拟的。

2.9 费用低

同时检测一个样本中的多项指标可节约时间、样本、试剂、耗材和劳动（比ELISA法低10～100倍），降低检测成本，同时还提高了分析效率，仅需少量样本即可获得大量信息。

2.10 灵活

适用于各种蛋白质和核酸的分析。商品化试剂盒的使用者只需增减探针交联微球和标记分子即可满足不同检测项目的需要。

3 液相芯片的不足

在蛋白分析过程中，由于部分血清中含有异嗜性抗体，可与微球或捕获抗体直接连接，从而形成非特异性的背景值，给实验造成严重干扰，这种效应类似于在免疫测定中由异嗜性抗体导致的干扰[1]。血清预先与聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、proprietary试剂培育，可以有效的减少非特异性的背景信号的产生，但是proprietary 试剂在减少背景信号的同时也减少特异性信号的产生[2]。应用luminex的SeroMap 微球仅能部分的解决这些问题。在核酸检测时要设计好偶联探针，保证其特异性。液相芯片是一个开放的技术平台，在进行多重PCR时，应注意防止PCR 产物污染实验室。

4 液相芯片技术的应用进展

液相芯片是继平面芯片之后的一种新型芯片技术，是一种非常灵活的多元分析平台，在核酸、蛋白质等生物大分子的大规模分析中具有巨大的应用潜力，可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体-配体识别分析等众多领域的研究，蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用分析等都可以在同一个平台上实现。鉴于液相芯片技术在高通量定性和定量检测上令人瞩目的优势，目前它在基因组学研究、蛋白质组学研究、药物开发、基础研究和临床诊断等方面的应用十分广泛，近几年来以此为平台的产品开发和应用十分活跃，研究者既可以根据研究需要自行制备探针交联微球，建立反应体系，也可使用种类繁多的商品化试剂盒进行分析。大体说来，液相芯片技术的应用包括两大部分：液相蛋白芯片和液相基因芯片，前者主要是基于抗原一抗体反应，而后者实质为核酸杂交。现将液相芯片技术在动物医学方面的应用展望如下：

4.1 动物细菌性传染病的检测

近年来应用液相芯片技术进行细菌性传染病病原体检测的研究日渐增多，涉及大肠杆菌、志贺氏菌、沙门菌、李斯特菌、空肠弯曲菌、葡萄球菌、霍乱弧菌、嗜肺军团菌、肉毒梭菌、脑膜炎奈瑟菌。

大肠杆菌、沙门菌、李斯特菌和空肠弯曲菌是食源性疾病常见的细菌性病原体，临床常规的检验方法包括培养、生化检测、酶标法和核酸扩增等，费时费力，且需要多次检测才可以明确所有的病原体。吕东月等[3]采用xMAP液相悬浮芯片检测方法，建立一管同时检测金黄色葡萄球菌、沙门菌、副溶血弧菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157∶H7、创伤弧菌和空肠弯曲菌的快速筛查方法。Dunbar SA 等[4]利用液相芯片技术完成对食源性疾病常见细菌病原体的多通道定量检测。Zhao J等[5]将液相芯片与多重PCR结合，快速筛检样品中志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、嗜肺军团菌和肉毒梭菌等10株致病菌。邱杨等[6]建立沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌和副溶血弧菌等5种致病菌的快速液相芯片检测方法。

4.2 动物病毒性传染病的检测

液相蛋白芯片技术还可应用于动物疾病的检测诊断，如禽流感、口蹄疫等。张晓娜[7]成功地建立了检测AIVH5、H7、H9、 NDV、IBV和ILTV 6种病毒核酸的单重液相芯片和多重液相芯片的方法，为禽呼吸系统病毒性疾病的快速、高通量鉴别诊断搭建了新的技术平台，也为检测其他病毒性疾病病原的研究提供了新的思路；朱向博[8]研究成功构建了同时检测 PPV、PCV2、PRRSV、CSFV 的四重液相芯片快速检测方法，为猪病的快速高通量鉴别诊断搭建新技术平台，也为液相芯片技术在动物多病毒快速高通量检测、鉴别诊断等应用方面奠定了基础；刘志玲[9]等应用液相芯片技术原理，以原核表达的重组牛白血病病毒gp51蛋白为抗原，建立了检测牛白血病病毒抗体的Liquchip液相蛋白芯片检测方法。

5 液相芯片的应用展望

液相芯片技术出现于以功能基因组学和蛋白质组学为核心的后基因组时代，从20世纪末发明至今仅十余年时间，却已经应用于生命科学研究中的诸多领域。当然，液相芯片技术在动物疾病诊断检测领域的应用也将会更加的宽泛。该技术可同时检测多种目的物，而且对同一样本可同时检测不同的指标，达到多重检测的目的。在进出口动物检疫中，对几种常检、必检的动物传染病检疫可一次完成，并且检测样本需要量少，对活检动物无多大影响。在动物食品的兽药残留上，可对多种不同的兽药进行同时检测，可大大提高检测效率，满足口岸检疫中快速检验的要求。待该技术发展成熟时，对动物病毒类传染病、细菌类传染病甚至是病毒与细菌混合感染的传染病都可同时进行检测，迅速作出诊断，可为重特大类动物疾病预警的快速反应机制提供参考数据。因此，在动物疾病诊断领域，液相蛋白芯片将会有更加广阔的应用前景。

[1] Martins TB，Pasi BM，Litwin CM，et al. Heterophile antibody interferencein a multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for quantitation of cytokines in human serum[J]. Clin Diagn Lab Immunol，2004，（11）：325-328．

[2] Waterboer T，Sehr P，Pawlita M.Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays[J]. J Immunol Methods，2006，309（1-2）：200-204.

[3] 吕东月，晓路，陈妙龄，等.常见7 种食源性致病菌xMAP液相芯片快速筛查方法的建立及应用[J].卫生研究，2012，41（1）：96-101．

[4] Dunbar SA，Vander Zee CA，Oliver KG，et al. Quantitative，multiplexed detection of bacterial pathogens：DNA and proteinapplications of the Luminex LabMAP system[J]. J MicrobiolMethods，2003，53（2）：245-252.

[5] ZHAO J，KANG L，HU R，et al. Rapid oligonucleotide suspension array-based multiplex detection of bacterial pathogens[J].Foodborne Pathog Dis，2013，10（10）：896-903.

[6] 邱杨，肖性龙，吴晖等.五种致病菌流式液相芯片检测方法的建立[J]. 现代食品科技，2010，26（8）：889-893，909.Methods，2003，53（2）：245-252.

[7] 张晓娜.AIV，NDV，IBV和ILTV液相检测芯片方法的建立[D].南京农业大学，2012.

[8] 朱向博.四种猪病病原的液相芯片检测方法的建立[D].西北农林科技大学，2012.

[9] 刘志玲，陈茹，舒鼎铭，等.牛地方流行性白血病液相蛋白芯片检测方法的建立[J].中国兽医科学，2012，42（1）：26-30.

上海市市级农口系统青年人才成长计划（沪农青字（2014）第2-11号）