既往有偿献血HIV-1感染者中合并感染的HCV对telaprevir和boceprevir天然耐药分析

鲍毅，田地，郑颖颖，席宏丽，刘丹，于敏，徐小元

既往有偿献血HIV-1感染者中合并感染的HCV对telaprevir和boceprevir天然耐药分析

鲍毅，田地，郑颖颖，席宏丽，刘丹，于敏，徐小元

目的分析既往有偿献血人群HIV-1感染者中合并感染的HCV对telaprevir和boceprevir的天然耐药，为HCV的耐药监测及临床抗病毒治疗提供基础数据。方法收集既往有偿献血人群HIV阳性患者的血浆样本，检测其HCV抗体，应用巢式PCR扩增HCV NS3/4A区，对测序结果进行耐药分析，计算耐药率，评价耐药毒株的流行趋势。结果从150份符合要求的样本里共获得70份（46.67%）HCV NS3/4A基因序列。检测出耐药相关突变4例（5.71%），其中对boceprevir耐药2例（2.86%），耐药位点为R117H和A156V；对telaprevir耐药2例（2.86%），耐药位点为R117H和A156V；对telaprevir可能耐药2例（2.86%），耐药位点为T54S。尚未发现V36A/M/L/C、Q41H/R、F43C/S、T54A、V55A、Q80R、R109K、S138C、R155G/I/K/M/T/Q/S、A156S/T、D168A/E/G/H、V170A/T/I、N174G/S、L175M等已报道的耐药位点。其他突变中，氨基酸替换率超过90%的变异位点有I35V、A40T、R62K、I64L、V71I、S66G、S91A和T42S；在系统进化树中，耐药序列呈点状散在分布，未发现聚集性。结论既往有偿献血HIV-1感染者中合并感染的HCV对telaprevir和boceprevir存在天然耐药，耐药相关突变率分别为5.71%和2.86%。其他氨基酸位点出现突变率较高，但是未发现与耐药相关。各耐药菌株之间未发现传播关联性。

丙型肝炎病毒；HIV；蛋白酶抑制药；药物耐受性；供血者

HIV和HCV有着共同的传播途径：血液传播、性传播和垂直传播，因此HIV-1和HCV常发生合并感染[1-2]。在我国，以静脉注射毒品和输血为传播途径的HIV-1感染者中，合并HCV感染率达85%～97%[3-4]。一般情况下，70%以上的HCV感染可能发展为慢性，其中有10%～20%在感染20年后可发展至肝硬化，1%～5%在感染30年后可发展为肝癌[5]。当合并HIV-1感染时，HIV-1通过对免疫抑制或免疫紊乱的影响引起HCV感染后复制水平升高，肝硬化发病率更高，疾病进展更快[6-7]。可见对合并HCV/ HIV感染者进行有效的抗HCV治疗是有必要的。

近年来，HCV的直接抗病毒治疗药物研究进展迅速，针对NS3/4A的蛋白酶抑制剂（boceprevir和telaprevir）已在美国上市，其中美国Vertex公司研制的telaprevir联合聚乙二醇干扰素（pegylated interferon,Peg-IFN）和利巴韦林治疗HCV基因1型感染的病毒学应答率达80%以上，优于Peg-IFN联合利巴韦林的抗HCV治疗[8-9]，其应用前景已写入2011年最新的欧洲肝脏病学会HCV感染管理指南[10-12]。但HCVNS3区的V36M/A、T54A、R155K/T和A156V/ T变异可引起病毒耐药[13]，有研究发现在未接受治疗的患者中可检出耐药位点，而引起天然耐药[14-15]。目前我国既往有偿献血人群中HIV-1/HCV合并感染者对蛋白酶抑制剂的耐药情况尚不清楚。

本研究对我国中部地区20世纪90年代中期因有偿献血感染HIV-1者的血液标本中合并感染的HCV进行耐药检测，了解其对telaprevir和boceprevir的天然耐药特征。

1 对象与方法

1.1 对象150份由北京佑安医院艾滋病中心2005—2007年收集的河南省有偿献血者血浆，均经当地疾病预防控制中心采用Western blot法确证为HIV感染。HCV IgG抗体检测采用意大利DiaSorin公司生产的HCV抗体酶联免疫诊断试剂盒。采集血液之前，患者未使用任何抗病毒药物、干扰素和蛋白酶抑制剂，血样经乙二胺四乙酸（EDTA）-2k抗凝，保存于-80℃冰箱备用。

1.2 HCVRNA的提取从每份样本中取200μl血浆，按照MiniBESTViralRNA/DNAExtraction KitVer. 4.0试剂盒（TaKaRa公司，大连）说明提取HCVRNA。

1.3 巢式PCR基因片段的扩增参照HCV标准株（H77，基因库编号AF009606）的序列，按巢式PCR法设计合成2对PCR引物，使用PrimeScript® One Step RT-PCR Kit Ver.2扩增HCV NS3/4A区。反应条件如下：第1轮，以HCV NS3F1/HCV NS3R1为外侧引物，取2×1 Step Buffer 12.5μl，PrimeScript One Step Enzyme1 1μl，引物各2μl，7.5μlRNA为反应模板，配成25μl的反应体系，进行第1次PCR反应，50℃30min，94℃2min，1个循环；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，35个循环；72℃10min。第2轮，以HCV NS3F2/HCV NS3R2为内侧引物，10×Ex缓冲液5μl，10mmol/L 4dNTPmix（final2.5mmol/L）4μl，Ex Taq（5 U/μl）0.3μl，引物各4μl，去离子水27.7μl，取第1轮PCR产物5μl做模板，配成50μl的反应体系，94℃5min，1个循环；94℃30 s，55℃30 s，72℃50 s，30个循环；72℃10min。具体引物序列见表1。每次实验前后严格清理超净工作台、移液器和试验台，并用紫外线消毒，严格做阴性对照。

1.4 电泳和测序取5μl第2轮PCR产物，用2.0%琼脂糖凝胶，100 V电压，电泳30min。电泳结果与100 bp的Marker比对，鉴定无误后，PCR产物送到北京诺赛公司测序，引物为HCV NS3seq：5'-CCTATCACGGCACTCCCAACA-3'。

1.5 耐药性分析扩增产物经测序获得基因序列，在HCV数据库（http://hcv.lanl.gov/content/sequence/ HCV/ToolsOutline.htm l）网站下载HCV参考株序列，用MEGA 4.02软件Align by clustalW比对基因序列，用邻接法构建系统进化树。提交HCV耐药数据库（http://hcv.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php）［Geno2Pheno（hcv）V1.0 table，Max-Planck-Institute Informatik, Saarbrucken,Germany］进行分析，寻找boceprevir/ telaprevir耐药相关突变。病例样本检测结果按抗病毒药物敏感、潜在耐药和耐药进行评估判断。

表1 HCV NS3/4A区扩增的巢式PCR引物的名称、序列、位置和长度Table 1 Name,sequence,position and length of HCV NS3/4A area augmentation of nested PCR primers

2 结果

2.1 一般情况150例年龄29～60岁，平均44.7岁；其中男86例，女64例；HCV抗体阳性106例。共成功测序获得70份（46.67%）HCV NS3/4A基因序列，序列长度约790 bp，提交到HCV耐药数据库检测发现基因1b型68例（97.14%），基因2a型2例（2.86%）。

2.2 耐药位点提交所有序列到HCV耐药数据库检测，发现T54S、A156V、R117H这3个耐药位点。耐药样本4例，具体耐药位点分别是HNDB2：T54S，HNDB22：A156V，HNDB31：R117H，HNDB34：T54S（图1）。

2.3 耐药率分析许多体内和体外研究已发现HCV NS3/4A区的氨基酸替换可导致对蛋白酶抑制剂耐药，本研究检测到的耐药位点有T54S、R117H和A156V，分别占2.86%、1.43%和1.43%。耐药样本共4例（5.71%），其中对boceprevir耐药2例（2.86%），耐药位点为R117H（1.43%）和A156V（1.43%）；对telaprevir耐药2例（2.86%），耐药位点为R117H（1.43%）和A156V（1.43%），对其可能耐药2例（2.86%），耐药位点为T54S。未检测到V36A/M/L/C、Q41H/R、F43C/S、T54A、V55A、Q80R、R109K、S138C、R155G/I/K/M/T/Q/S、A156S/T、D168A/E/G/H、V170A/T/I、N174G/S、L175M等已报道的耐药位点[13，16-17]（表2）。

图1 既往有偿献血感染HIV-1人群中HCV NS3/4A区对boceprevir/telaprevir的耐药位点Figure 1 HCV NS3/4A resistance loci of boceprevir/tela-previr in previous paid blood donorsw ith HIV-1 infection

表2 HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂耐药突变的分布Table 2 Distribution of HCV NS3/4A protease inhibitor resistancemutations

2.4 其他突变位点除了以上发生耐药突变的氨基酸位点外，HCV NS3/4A还发生其他的碱基变异导致氨基酸替换。根据H77参考株，本组中替换率最高的为I35V和A40T（均高达100%），其次是R62K、I64L、V71I等，高达97.1%；S66G、S91A和T42S替换率分别是95.7%、92.9%和91.4%。

2.5 HCV NS3/4A序列系统进化树分析70份基因序列经过系统进化树分析，HNDB19和HNDB24聚集在参考株2a-JFH-1-AB047639，属于2a型；其他序列都聚集在参考株1b-AH1-AB429050，属于1b型，标记的耐药序列呈点状散在分布，未发现聚集性。

3 讨论

HCV是丙型肝炎的病原体，为黄病毒科，球形颗粒，直径约50 nm，有包膜。其基因组为单股正链的RNA病毒，全长约9.6 kb，含1个开放阅读框，HCV基因组翻译成1个聚蛋白前体，可经蛋白酶水解为10个具有多种生物活性的病毒蛋白：Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，这些病毒蛋白在HCV的生活史中发挥着重要的作用[18]。病毒复制时的高自然错配率（大约每个基因每次复制周期可发生1个核苷酸错配）及RNA聚合酶的低保真性导致HCV基因极易突变，产生耐药，成为直接抗病毒治疗药物临床研究中的主要挑战[19]。

目前对慢性HCV感染以干扰素加利巴韦林为主要治疗手段[20]，但价格昂贵，不良反应较多，因此急需新型抗HCV药物的出现[8-9]。多种针对HCV的新型药物如蛋白酶抑制剂和RNA聚合酶抑制剂等已被证明可强效抑制HCV复制，迅速降低血清HCVRNA水平，并缩短疗程。Telaprevir和boceprevir现已在美国上市[10-12]。

然而，由于基因变异的影响，在同一患者体内存在一系列HCV的准种群，当进行抗病毒治疗时，药物的选择压力可导致耐药菌株成为优势株，从而引起继发耐药[21]。但如果用药前耐药变异株在病毒准种池中已成为相对优势株，在用药后能迅速成为绝对优势株而引起原发耐药[15，22]，这种情况已在未经治疗的慢性丙型肝炎中得到发现。Franco等[14]采用Allelespecific PCR检测45例未治疗的HCV基因1b型感染者的天然耐药，检测到A156T 23例（51%），A156V 13例（29%），A156S1例（2%）和V36A 12例（27%）等耐药突变。Bartels等[17]研究发现570例未治疗的HCV感染者体内的HCV存在耐药变异，产生耐药位点分别是V36M（0.9%）、R155K（0.7%）、V170A（0.2%）和R109K（0.2%）。Vicenti等[15]对67例基因1a亚型和42例基因1b亚型未接受蛋白酶抑制剂治疗的意大利HCV感染者测序发现，至少有1个突变位点的有21例（19.3%），10例检测到与boceprevir和telaprevir耐药相关突变（9.2%），耐药位点是V36L、T54S和V55A，其中1例同时检测到V36L和T54S突变。

本研究检测到T54S（2.86%）、A156V（1.43%）和R117H（1.43%）3个耐药位点，耐药样本4例（5.71%）。R117H/A156V单独突变都能引起telaprevir和boceprevir耐药，T54S单独突变只能引起telaprevir的可能耐药，不能引起boceprevir耐药。尚未发现V36A/M/L/C、Q41H/R、F43C/S、T54A、V55A、Q80R、R109K、S138C、R155G/I/K/M/T/Q/S、A156S/T、D168A/ E/G/H、V170A/T/I、N174G/S、L175M等已报道的耐药位点[14-15]。本实验阳性率较低，可能的原因是标本存放较久。所有样本虽然未使用蛋白酶抑制剂，但仍然检测到了部分国外已经报道的耐药位点，提示我国HCV感染者天然存在对telaprevir和boceprevir耐药。根据H77参考株，检测到HCV NS3/4A基因序列还发生其他的碱基变异导致氨基酸替换，部分碱基的替换可能会引起反转录酶或蛋白酶分子的空间构型发生改变，致使病毒对治疗药物的敏感性降低，导致HCV耐药性的出现[22]。在抗病毒治疗过程中，药物选择压力可使耐药病毒株迅速成为患者体内主要病毒株，导致耐药发生[22]。基因序列经过进化树分析，提示河南省既往有偿献血HIV-1感染者中合并感染的HCV基因型以1b型为主，耐药序列呈点状散在分布，未发现聚集性。可能的原因为该省有偿献血HIV-1感染者中合并HCV感染的时间较久，耐药位点在感染者体内自发突变，而非来自不同患者间的传播。

总之，既往有偿献血感染HIV-1人群中合并感染的HCV对telaprevir和boceprevir存在天然耐药，但耐药水平处在较低状态。抗HCV药物在提高持续病毒学应答率、缩短疗程、提高耐受性和降低耐药危险性方面还有很长的路。

志谢非常感谢北京佑安医院吴昊教授和夏炜老师的热心帮助

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（2014-01-21收稿 2014-03-28修回）

（责任编委 张玲霞 本文编辑 陈玉琪）

Naturally occurring HCV resistance to telaprevir and boceprevir in previous paid blood donorsw ith HCV/HIV-1 co-infection

BAO Yi,TIAN Di,ZHENG Ying-ying,XIHong-li,LIU Dan,YU Min,XU Xiao-yuan*
Department of Infectious Diseases,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China
*Corresponding author,E-mail:yangpin@public3.bta.net.cn

Objective To analyze naturally occurring HCV resistance to telaprevir and boceprevir in previous paid blood donorswith HCV/HIV-1 co-infection,and provide basic data fordrugmonitoring and antiviral therapy for HCV.M ethods Plasma samples were collected from previous paid blood donors with HIV-1 infection,and HCV antibodies were detected.The HCV NS3/4A region was amplified using nested PCR,and drug resistance analysis was made by calculating resistance rate and assessing the prevalence of resistant strains.Results A total of 70(46.67%)fragments containing HCV NS3/4A region were successfully amplified from 150 samples.Drug resistance-related mutations were detected in 4(5.71%)patients,resistance to boceprevir in 2 patients (2.86%),with the resistance lociof R117H and A156V,and resistance to telaprevir in 2(2.86%)patients,with the resistance loci of R117H and A156V;possible resistance to telaprevir was found in 2(2.86%)patients,with the resistance locus of T54S.Previously reported resistance loci,such as V36A/M/L/C,Q41H/R,F43C/S,T54A,V55A,Q80R,R109K,S138C,R155G/I/K/M/T/Q/S,A156S/ T,D168A/E/G/H,V170A/T/I,N174G/S and L175M,were not detected.I35V,A40T,R62K,I64L,V71I,S66G,S91A and T42S exhibited a high replacement rate of over 90%.Phylogenetic analysis showed that drug resistance lociwere scatteredly distributed in the phylogeny tree,and no aggregation was detected.Conclusions HCV resistance to telaprevir and boceprevir occurs naturally in previous paid blood donorswith HCV/HIV-1 co-infection,with the resistance rates of 5.71%and 2.86%,respectively.Other loci exhibit highmutation rates,but no correlation with drug resistance is found.Moreover,no correlation is found among the resistant strains.

HCV;HIV;protease inhibitors;drug tolerance;blood donors

R373.21；R373.51

A

1007-8134(2014)03-0160-04

国家“十二五”科技重大专项（2012ZX10002003-004-003）；北京市科委2012年度科技计划重大项目（D121100003912-003）

100034，北京大学第一医院感染疾病科（鲍毅、田地、郑颖颖、席宏丽、刘丹、于敏、徐小元）

徐小元，E-mail:yangpin@public3.bta.net.cn