HPLC测定复方头孢克洛胶囊含量、含量均匀度及溶出度的研究

2014-06-07张琼杨利红苏蕊

中国医学创新 2014年17期

张琼杨利红苏蕊

复方头孢克洛胶囊处方源于德国药物目录（Pharm Ndex）收载的MUCO Panoral-250，马丁代尔药典（Martndale）也收载了头孢克洛的多组分制剂（Multiingrendient Preparation），Ger（德国）：MUCO Panoral，具有抗感染、止咳祛痰等功效[1-3]。本实验建立以乙腈-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值至3.0）（22：78）为流动相HPLC方法，同时测定复方制剂中头孢克洛和溴己新的含量、含量均匀度及溶出度，其专属性强、灵敏度高、操作简便，可更有效地控制药品质量[4-6]。

1 材料

1.1 仪器岛津2010A HCT液相色谱仪（紫外检测器，工作站），Satorius CP2115天平。

1.2 试药与试液头孢克洛（批号：130481-200904）、盐酸溴己新（批号：100427-200301），上述对照品均来自中国药品生物制品检定所。乙腈：色谱级，其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水（Milli-Q Plus超纯水系统）制备。

2 方法

2.1 色谱条件色谱柱：Waters Shield RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相：乙腈-0.025 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值至3.0）（22：78）；流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长249 nm；进样量：20 μL。理论板数：以溴己新计为11 215；分离度：头孢克洛与溴己新的分离度为36.14。该色谱条件下的色谱图见图1。

图1 复方头孢克洛胶囊HPLC色谱图

2.2 试验方法取本品20粒，精密称取其内容物（约相当于头孢克洛50 mg），置100 mL量瓶中，加甲醇30 mL溶解，超声15 min助溶，冷却至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；取盐酸溴己新对照品约32 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液5 mL，置100 mL量瓶中，加入精密称取的头孢克洛对照品约50 mg，加流动相溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液和对照品溶液各20 μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

3 方法学考察

3.1 含量均匀度的测定

3.1.1 含量均匀度线性试验精密称取盐酸溴己新对照品22.95 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液2 mL，置50 mL量瓶中，加入精密称取的头孢克洛对照品124.41 mg加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密量取对照品储备液3、4、5、6、7、9 mL置25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度的溶液，按照上述色谱条件依法测定，以浓度与其峰面积进行线性回归，结果头孢克洛和盐酸溴己新回归方程分别为：Y=19 702X+46 386，r=1.0000；Y=28 912X+1334.2，r=1.0000。线性范围分别为280.97~842.90 μg/mL和11.00~33.01μg/mL。

3.1.2 精密度试验精密量取含量测定项下的对照品溶液20 μL，按照上述色谱条件，连续进样5次，计算头孢克洛和盐酸溴己新峰面积的RSD分别为0.11%和0.24%。试验结果表明本方法的精密度良好。

3.1.3 重复性试验取批号为13020401的复方头孢克洛胶囊内容物各6份，分别按照“2.2”项下方法进行重复性试验。结果头孢克洛和溴己新含量（标示量%，n=6）分别为101.3%和99.6%，RSD分别为0.09%和0.91%。

3.1.4 加样回收试验精密称取盐酸溴己新对照品16、20 mg和24 mg分别置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液2 mL，置10 mL量瓶中，分别加入精密称取的头孢克洛40、50 mg和60 mg，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液（低、中、高浓度溶液各平行制备3份）；另取已测知头孢克洛和溴己新含量的批号为13020401的复方头孢克洛胶囊内容物约16 mg（n=9），分别置50 mL量瓶中，精密加入各浓度水平的储备液2.5 mL，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件进行加样回收试验。结果复方头孢克洛胶囊中头孢克洛低、中、高3种浓度的平均回收率（n=3）分别为99.8%（RSD=0.25%）、100.1%（RSD=0.35%）和100.3%（RSD=0.86%），溴己新低、中、高3种浓度的平均回收率（n=3）101.2%（RSD=0.47%）、100.9%（RSD=0.68%）和100.4%（RSD=0.98%）。

3.1.5 溶液的稳定性考察取含量测定下的供试品溶液，按上述色谱条件，在0、2、4、8、12、25 h依法测定头孢克洛和溴己新的峰面积，结果RSD（n=6）分别为0.60%和0.53%，表明溶液中头孢克洛和溴己新在25 h内稳定。

3.1.6 含量均匀度考察应用本文建立的HPLC含量测定方法，进行两个批号分别为13020401和131108的复方头孢克洛胶囊中溴己新含量均匀度检查。取供试品1粒，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过；精密量取续滤液5 mL置25 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，按照含量测定项下的方法测定，同时按复方头孢克洛胶囊现行标准，以氯仿为溶剂，采用紫外分光光度法在252 nm波长处测定溴己新的含量均匀度[7-8]。两种方法测定的结果有明显差异，见表1。

表1 溴己新含量均匀度测定结果

3.2 溶出度测定

3.2.1 溶出实验本实验结合《中国药典》2010年版二部中头孢克洛胶囊[9]，盐酸溴己新片与复方头孢克洛胶囊现行标准YBH04602003中溶出度的方法[8]，照《中国药典》2010年版二部附录XC第一法，以水900 mL为溶剂，转速为100 r/min，依法操作，测定了两批复方头孢克洛胶囊的溶出曲线，经5、15、30、45、60 min时取溶出液10 mL，用有机膜滤过[9]，至少弃去初滤液5 mL，取续滤液作为供试品溶液；另取头孢克洛与盐酸溴己新对照品各适量，制成相应浓度对照品溶液，照2.1色谱条件，精密量取供试品溶液和对照品溶液各50 μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，计算头孢克洛和溴己新不同时间的溶出量。溶出实验结果表明，30 min，6粒胶囊中头孢克洛平均溶出量达到90%以上，溴己新平均溶出量达到70%以上，6粒胶囊中头孢克洛与溴己新的溶出曲线见图2~3。

3.2.2 溶出度线性关系试验取盐酸溴己新对照品20.70 mg置10 mL量瓶中，加乙醇5 mL溶解，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液2 mL置25 mL量瓶中，加入精密称取头孢克洛对照品125.50 mg，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液3、4、5、8 mL和10 mL置100 mL量瓶中，加溶出介质稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度的溶液，按照2.1色谱条件，精密量取50 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度与其峰面积进行线性回归，结果头孢克洛和盐酸溴己新回归方程分别为：Y=18 166X+3 737 535，r=0.9991；Y=63 769X-30 211，r=0.9991。线性范围分别为141.71~472.38 μg/mL和4.83~14.53 μg/mL。

图2 头孢克洛溶出曲线图

图3 溴己新溶出曲线图

3.2.3 加样回收试验精密称取盐酸溴己新对照品16 mg、20 mg和24 mg分别置20 mL量瓶中，加适量乙醇（每2 mg加乙醇1 mL）溶解，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液2 mL，置25 mL量瓶中，分别加入精密称取的头孢克洛50、62和74 mg，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液（低、中、高浓度溶液各平行制备3份）；另取已测知头孢克洛和溴己新含量的批号为13020401的复方头孢克洛胶囊内容物约16 mg（n=9），分别置100 mL量瓶中，精密加入各浓度水平的储备液5 mL，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，按2.1色谱条件，精密量取50 μL注入液相色谱仪，进行加样回收试验。结果复方头孢克洛胶囊中头孢克洛低、中、高3种浓度的平均回收率（n=3）分别为99.6%（RSD=0.22%）、100.0%（RSD=0.50%）和100.2%（RSD=0.64%），溴己新低、中、高3种浓度的平均回收率（n=3）100.8%（RSD=0.72%）、101.3%（RSD=0.88%）和99.9%（RSD=0.47%）。

3.2.4 溶液的稳定性考察取30 min溶出液作为供试品溶液，按上述色谱条件，在0、2、4、8、12 h依法测定头孢克洛和溴己新的峰面积，结果RSD（n=5）分别为0.34%和0.55%，表明溶液中头孢克洛和溴己新在12 h内稳定。

3.2.5 滤膜的吸附作用取30 min溶出液，分别将原液，无机膜过滤弃去1、2、5 mL初滤液后的溶出液与有机膜过滤弃去1、2、5 mL初滤液后溶出液，精密量取50 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明有机膜过滤弃去5 mL初滤液的溶出液中，头孢克洛与溴己新测定值均与原液测定值的平均偏差小于0.02%，可消除滤膜对头孢克洛与溴己新的吸附影响。