一测多评法检测头孢克洛胶囊中3 种已知杂质*

路惬楠，张素平，王 柳，张轶华

（河北省药品医疗器械检验研究院·国家药品监督管理局仿制药质量控制与评价重点实验室，河北 石家庄 050200）

头孢克洛为第2代半合成头孢菌素类抗菌药物，其可抑制细菌细胞壁合成，临床主要用于治疗敏感菌所致呼吸系统、泌尿系统、耳鼻喉科、皮肤、软组织等的感染。2020 年版《中国药典（二部）》收载了头孢克洛原料及制剂，在有关物质项下规定了头孢克洛峰与头孢克洛δ-3-异构体峰之间的分离度应不小于2.0，规定了单个杂质和杂质总和的限度，但未对各已知杂质进行控制。头孢克洛原料及制剂的有关物质水合羟基化头孢克洛［1］、头孢克洛δ-3-异构体［2-4］均有系统报道，也有对头孢克洛胶囊中12 种未知杂质的检测［5］，但尚未见用一测多评法对3种已知杂质（头孢克洛δ-3-异构体、水合羟基化头孢克洛、杂质Ⅰ）进行定量控制的报道。高效液相色谱（HPLC）法是目前药品有关物质检查最常规的手段，但其常用的外标法常受杂质标准物质获得困难等因素制约。一测多评法由于在日常检验中省去了杂质标准物质，又同时考虑了杂质与主成分的响应因子可能不同所引起的测定误差，准确度较好［6-15］。本研究中探讨了一测多评法用于控制头孢克洛胶囊中3种已知杂质的可行性，为该制剂的质量控制提供了参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪，包括紫外-可见分光检测器（美国Waters公司）；MCM36型电子天平（德国Sartorius公司，精度为0.001 mg）。

1.2 试药

头孢克洛胶囊（某厂，批号分别为E382191102，E362191103，E392191104）；头孢克洛对照品（中国食品药品检定研究院，批号为130481 - 202007，含量84.1%）；头孢克洛δ-3-异构体（欧洲药典对照品，批号为C0640000，含量100%）；水合羟基化头孢克洛对照品（批号为PITBK - 2- 20190112- 03，含量97.79%），杂质Ⅰ对照品（批号为PITBK-E-EP-YN0529-01，含量97.74%），均购自广州牌牌生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Sunfire C18柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）；流动相：0.78%磷酸二氢钠溶液（取磷酸二氢钠7.8 g，加水溶解并稀释至1 000 mL，用磷酸调pH 至4.0；A）-［0.78%磷酸二氢钠溶液pH 4.0 - 乙腈（55∶45，V/V）；B］，梯度洗脱（0～30 min 时95%A →75%A，30～45 min时75%A →0 A，45～50 min时0 A，50～51 min时0 A →95%A，51～61 min时95%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 µL；样品放置温度：4 ℃。

2.2 溶液制备

取头孢克洛对照品适量，精密称定，用0.27%磷酸二氢钠溶液（pH 2.5，下同）溶解并制成成每1 mL 约含头孢克洛10 µg 的对照品溶液。分别取头孢克洛、头孢克洛δ- 3 - 异构体、水合羟基化头孢克洛和杂质Ⅰ对照品各适量，精密称定，用0.27%磷酸二氢钠溶液（pH 2.5）制成1 mg/ mL 的单一对照品贮备液；分别精密量取头孢克洛对照品贮备液0.1 mL、头孢克洛δ-3-异构体对照品贮备液0.25 mL、水合羟基化头孢克洛对照品贮备液0.25 mL、杂质Ⅰ对照品贮备液0.15 mL，置10 mL 容量瓶中，用0.27%磷酸二氢钠定容，摇匀，作为混合对照品溶液。取20粒样品内容物，研细，取约相当于头孢克洛（按C15H14ClN3O4S）0.5 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，加0.27%磷酸二氢钠溶液溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验

分离度考察：取混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，结果出峰顺序依次为头孢克洛δ-3-异构体、头孢克洛、水合羟基化头孢克洛和杂质Ⅰ，各峰间的分离度依次为10.9，6.3，5.1，均达到完全分离。详见图1。

图1 分离度考察高效液相色谱图1.Cefaclor δ - 3 - isomer 2.Cefaclor 3.Impurity Ⅰ 4.Hydrated hydroxylated cefaclorFig.1 HPLC chromatograms of resolution test

破坏性试验：取供试品（批号为E382191102）适量，约相当于头孢克洛0.5 g，精密称定，置100 mL 容量瓶中，分别按下述方法破坏。1）未破坏。加0.27%磷酸二氢钠（pH 2.5）溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液。2）酸破坏。加入1 mol/L盐酸1 mL，室温放置1 h，加1 mol/L氢氧化钠1 mL，加0.27%磷酸二氢钠（pH 2.5）定容，摇匀，滤过，取续滤液。3）碱破坏。加入1 mol/L 氢氧化钠1 mL，室温放置1 h，加1 mol/L 盐酸1 mL，加0.27%磷酸二氢钠（pH 2.5）定容，摇匀，滤过，取续滤液。4）氧化破坏。加入30%过氧化氢溶液1 mL，室温放置1 h，加0.27%磷酸二氢钠（pH 2.5）定容，摇匀，滤过，取续滤液。5）内容物热破坏。置80 ℃加热1 h，取出放冷，加0.27%磷酸二氢钠（pH 2.5）溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液。6）溶液热破坏。加适量0.27%磷酸二氢钠（pH 2.5）溶解，置80 ℃加热1 h，取出放冷，加0.27%磷酸二氢钠（pH 2.5）稀释并定容，摇匀，滤过，取续滤液。7）光破坏。取未破坏溶液适量，置5 000 lx 照度下光照24 h。取破坏后的溶液适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果各降解杂质与主峰均分离良好。详见图2。

2.3.2 线性关系考察

精密量取头孢克洛、头孢克洛δ-3-异构体、水合羟基化头孢克洛和杂质Ⅰ的对照品贮备液各适量，用0.27%磷酸二氢钠（pH 2.5）分别稀释，制成系列对照品溶液，以质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。回归方程及线性范围见表1。

2.3.3 检测限与定量限考察

分别精密量取2.3.2项下最低质量浓度溶液适量，倍比稀释，并按2.1项下色谱条件进样测定，以信噪比为10∶1、3∶1时的进样量分别记作定量限、检测限。详见表1。

2.3.4 精密度试验

取2.3.2 项下最低质量浓度溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，头孢克洛、头孢克洛δ-3-异构体、水合羟基化头孢克洛和杂质Ⅰ峰面积的RSD分别为0.41%，0.18%，0.19%，0.13%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验

取混合对照品溶液适量，于5 ℃条件下放置0，6，12，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果头孢克洛、头孢克洛δ-3-异构体、水合羟基化头孢克洛和杂质Ⅰ峰面积的RSD均小于2.0%，表明混合对照品溶液在5 ℃放置24 h 内基本稳定。取2.2 项下供试品溶液，在5 ℃条件下放置0，6，12，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果头孢克洛、头孢克洛δ-3-异构体、水合羟基化头孢克洛、杂质Ⅰ在5 ℃放置6 h 内基本稳定，12 h 时杂质Ⅰ峰面积变大，24 h时杂质Ⅰ和水合羟基化头孢克洛均已降解。

2.3.6 重复性试验

称取样品适量，精密称定，各6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，头孢克洛、头孢克洛δ-3-异构体、水合羟基化头孢克洛、杂质Ⅰ含量的RSD分别为0.18%，0.18%，1.38%，1.32%（n= 6），表明方法重复性良好。

2.3.7 加样回收试验

取已知含量的样品（批号为E382191102）适量，共9份，分别加入低、中、高质量浓度的对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率，结果见表2。

表2 头孢克洛已知杂质加样回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test of cefaclor and three known impurities（n = 9）

2.4 相对校正因子（RCF）及相对保留时间（RRT）

以2.3.2 项下各线性回归方程中头孢克洛的斜率除以已知杂质的斜率作为各成分的RCF。结果头孢克洛δ-3-异构体、水合羟基化头孢克洛、杂质Ⅰ的RCF分别为0.83，1.07，1.34，RRT分别为0.87，1.10，1.05。

2.5 耐用性试验

精密量取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，考察不同液相色谱仪、品牌色谱柱、测定波长、柱温、流动相pH、流速条件下的RCF 及RRT。结果表明，色谱条件发生一定变化时无显著影响。详见表3、表4（表中色谱柱规格均为250 mm×4.6 mm，5µm）。

表3 相对校正因子的耐受性考察结果Tab.3 Results of the durability test of relative correction factors

表4 相对保留时间的耐受性考察结果Tab.4 Results of the durability test of relative retention time

2.6 有关物质检测

取3 批样品各适量，分别按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积，按加校正因子的主成分自身对照法计算各已知杂质含量，并与外标法计算结果比较。结果见表5，可见，2种方法对3种杂质含量的测定结果基本一致。

3 讨论

由破坏试验结果可见，头孢克洛胶囊内容物加热破坏对峰影响较小，而对溶液加热破坏最敏感，产生较多杂质，在试验中溶液应控制温度，强酸、强碱和光破坏使头孢克洛δ-3-异构体与水合羟基化头孢克洛含量均增加，氧化破坏在11 min 左右会产生较大破坏产物。因此加强产品包装的密闭性和遮光性十分必要。

本研究中考察了不同色谱条件对RRT 的影响，确定了各已知杂质相对主成分（头孢克洛）的RRT，利用标准曲线法测定3种已知杂质的校正因子，将供试品溶液稀释500倍作为自身对照，采用加校正因子的主成分自身对照法，计算3 种已知杂质的含量。所得结果与外标法所得结果无明显差异，表明RCF 的计算结果准确。将测得的RRT 和RCF 载入质量标准，可供常规检验使用，能降低因主成分与杂质的绝对校正因子不同而引起的测定误差，且无须长期使用杂质对照品，可替代外标法用于准确测定已知有关物质的含量。

综上所述，本研究中所建立的方法操作简单，结果准确，可用于头孢克洛胶囊的杂质检测。