绿衣枳壳总黄酮提取工艺的研究*

高伟城，蓝晓庆，潘 馨

(1.漳州卫生职业学院药学系，漳州363600;2.培力(南宁)药业有限公司，南宁530007;3.福建中医药大学药学院，福州350108)

绿衣枳壳总黄酮提取工艺的研究*

高伟城1，蓝晓庆2，潘 馨3

(1.漳州卫生职业学院药学系，漳州363600;2.培力(南宁)药业有限公司，南宁530007;3.福建中医药大学药学院，福州350108)

目的:研究绿衣枳壳中总黄酮的提取工艺。方法:采用正交试验法研究绿衣枳壳总黄酮的最佳提取工艺，考查了乙醇浓度、料液比、提取时间及提取次数对绿衣枳壳提取物中总黄酮量的影响。结果:确立了绿衣枳壳中总黄酮最佳提取条件为:90%的乙醇为溶剂、料液比为1∶10、提取时间为2 h、提取2次。结论:在最佳提取工艺条件下，绿衣枳壳提取物中总黄酮含量分别为60.914、60.788和60.915 mg/g，表明本研究提取工艺稳定可行。

绿衣枳壳，总黄酮，提取工艺，正交试验

绿衣枳壳来源于芸香科植物枸橘Poncirus trifoliate (L.)Raf近成熟的果实，具有破积消食、理气健胃的功效［1］。因品质优良，长期以来远销台湾地区、南韩、东南亚各国，是本省极具发展前途、可用于出口创汇的优质传统药材［2］。现代药理表明，其对处于不同状态的胃肠平滑肌具有双向调节作用，而主要有效成分为黄酮类化合物［3］。潘馨［4］等采用GC－MS法对绿衣枳壳挥发油进行分析，结果表明绿衣枳壳与其他枳壳品种在化学成分烯、醇、酸、烷烃上绝大多数相同，从化学成分上可以解释绿衣枳壳与枳壳有相同的用途。

因此，为深入研究其药效价值，本研究采用正交试验法优选绿衣枳壳的乙醇提取工艺，以期为其制剂及开发利用提供理论依据。

1 仪器与试药

Nicolet Evolution 300智能型紫外可见分光光度计(Thermo Scientific corporation)、FA2 104N万分之一天平(上海精密科学仪器有限公司)、DZF－300真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司)、RE－52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，柚皮苷(中国药品生物制品检定所，批号110722－201111)，乙醇等其他试剂为分析纯。绿衣枳壳药材采购于福建闽侯，经福建中医药大学药学院车苏容副教授鉴定为绿衣枳壳Poncirus trifoliate(L.)Raf。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取120℃干燥至恒重的柚皮苷对照品5.6 mg，用90%乙醇超声溶解，定容于25 ml的量瓶中，摇匀，即得，0.224 mg/ml的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备精密称取干燥至恒重的乙醇提取物干浸膏2.5 mg，用90%乙醇超声溶解，定容于25 ml的量瓶中，摇匀，即得，备用。

2.2 测定波长的选择将对照品及供试品溶液在200～400 nm范围内进行波长扫描，结果对照品与供试品溶液在283 nm处均有最大吸收峰，故选择283 nm作为检测波长。见图1。

图1 紫外光谱图

2.3 标准曲线的制备精密吸取柚皮苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 ml，分别置于25 ml的量瓶中，用90%乙醇超声称溶解并稀释至刻度，摇匀;以90%乙醇溶液作空白对照，在283 nm处测定吸光度A，以吸光度A为纵坐标，质量浓度C为横坐标，绘制标准工作曲线，得其回归方程为:A= 0．026 6 C－0．020 4(r=0．999 9)，线性范围为4.48～35.84 μg/ml。

2.4 加样回收率试验精密称取同一样品0.007 9 g，共6份，分别加入柚皮苷对照品，按照“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法制备供试品液，在283 nm处测定其吸光度值，计算回收率。结果平均回收率为97.79%，RSD%为0.84%，结果见表1。

2.5 供试品溶液的测定将上述供试品溶液，按标准曲线下的测定方法测定其吸光度值，依回归方程计算得到总黄酮的质量浓度，再计算干浸膏中的总黄酮量。

2.6 单因素试验

2.6.1 乙醇浓度的考查精确称取6份绿衣枳壳粗粉10.0 g，分别加入浓度为40%、50%、60%、70%、80%和90%的乙醇100 ml，料液比为1∶10，加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液并减压浓缩至干浸膏，按供试品溶液方法进行测定，重复3次，结果见表2;可知，随着乙醇浓度的提高，绿衣枳壳总黄酮量呈上升趋势，乙醇浓度为70%～90%时总黄酮含量高于其他的浓度。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

表2 __乙醇浓度对总黄酮量的影响

2.6.2 料液比的考查精确称取6份绿衣枳壳粗粉10.0 g，分别加入浓度为80%的乙醇60、80、100、120、150和180 ml，料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15和1∶18，加热回流提取2次，每次1 h，合并提取液并减压浓缩至干浸膏，按供试品溶液方法进行测定，重复3次，结果见表3;可知，随着料液比的升高，料液比为1∶12时总黄酮含量增加不是很明显。

表3 料液比对总黄酮量的影响

2.6.3 提取时间的考查精确称取6份绿衣枳壳粗粉10.0 g，分别加入浓度为80%的乙醇100 ml，料液比为1∶10，加热回流提取2次，提取时间分别为1、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 h，合并提取液并减压浓缩至干浸膏，按供试品溶液方法进行测定，重复3次，结果见表4;可知，随着提取时间的延长，总黄酮含量于2.0 h处逐渐趋于平缓，在5.0 h时达到最高点。

表4 提取时间对总黄酮量的影响

2.7 正交试验及其结果在实验中，由于各因素之间相互交叉影响，因此为全面考虑乙醇提取法的工艺参数，根据单因素初筛试验结果，确定以乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为四种因素进行正交试验设计，我们以总黄酮量为考查指标，进行L9(34)正交试验，以测定绿衣枳壳中总黄酮含量，因素水平表见表5，结果见表6，方差分析见表7。

表5 因素水平表

表6 L9(34)正交试验结果

表7 方差分析

从极差和方差分析可知，以总黄酮含量为评价指标，各因素对提取效果的影响程度依次为A＞B＞D＞C，其中因素A(乙醇浓度)有显著性影响，取A3即90%乙醇为提取溶剂，B、D、C均无显著性影响，均为次要因素;因此，从节省时间及大生产的实际要求考虑，绿衣枳壳总黄酮的最佳提取工艺条件可定为A3B2C1D2，即用90%乙醇、1∶10的料液比、提取时间为1.5 h、提取次数为2次。

2.8 验证试验精确称取3份绿衣枳壳药材粗粉10.0 g，按照最佳工艺条件平行操作，A3B2C1D2进行试验，结果总黄酮含量分别为60.914、60.788和60.915 mg/g;验证的试验结果表明本研究优选的提取工艺稳定可行。

3 讨论

3.1 总黄酮含量测定方法一般有NaNO2－Al(NO3)3－NaOH法、三氯化铝比色法、碱比色法、直接测定法等。江周虹研究表明［5］，采用柚皮苷直接测定法作为枳壳中总黄酮的含量测定效果较好，故本试验参考文献中对于含有柚皮苷等类似成分的黄酮的紫外测定方法，选择绿衣枳壳中含有的黄酮类成分柚皮苷［6］为指标成分，采用直接测定法对其进行总黄酮含量测定。

3.2 绿衣枳壳是本省大宗道地药材之一，其主要黄酮类化合物为二氢黄酮类，有柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等，具有许多生理活性。因此，对其进行开发与利用，对促进地方经济发展、满足地方用药和外贸出口需要有十分现实的意义。

3.3 本研究提取工艺具有稳定性好、总黄酮量高、操作简便等优点，为绿衣枳壳总黄酮的深度开发奠定了一定的基础。

1黄坚航.福建绿衣枳壳的本草考证［J］.中药材，2001，24(6):429－430

2李煌，张梦云.不同采收期绿衣枳壳中柚皮苷的含量测定［J］.中国中医药信息杂志，2008，15(7):43－44

3徐优晓，苏孝共.枳壳理气作用的临床运用［J］.江西中医药，2005，36 (5):57－58

4潘馨，梁鸣.绿衣枳壳中挥发油的气质联析［J］.药物分析杂志，2004，24(2):200－202

5江周虹.枳壳总黄酮的质量控制及肠吸收研究［D］.杭州:浙江大学，2007:4－6

6潘馨.绿衣枳壳中柚皮苷含量的测定方法的研究［J］.中南药学，2005，3(2):82－83

R284

A

1006－5687(2014)02－0038－03

2014－01－13

福建省自然基金项目(No.2006F5053);陈可冀基金项目(No.CKJ2008084)