HPLC法测定脉络通中丹酚酸B的含量*

2014-06-05曲佳

天津药学 2014年2期

关键词：脉络酚酸溶剂

曲佳

(天津市药品检验所，天津300070)

HPLC法测定脉络通中丹酚酸B的含量*

曲佳

(天津市药品检验所，天津300070)

目的:建立高效液相色谱法测定脉络通中丹酚酸B的含量。方法:采用Agilent ZORBAX SB－C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)色谱柱;流动相以乙腈－甲醇(10∶30)为流动相A，以甲酸－水(1∶59)为流动相B，进行梯度洗脱;检测波长为286 nm。结果:丹酚酸B在0.029 87～0.597 4 μg范围内线性关系良好(r=0.999 9)，平均回收率为100.83%，RSD为2.03%(n=6)。结论:本方法灵敏、准确，可作为脉络通的质量控制方法。

高效液相色谱法，脉络通，丹酚酸B

脉络通为《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第二册收载的品种，由黄连、人参、丹参、郁金、三七、琥珀、安息香、檀香、降香、木香、甘松、石菖蒲、钩藤、麦冬、黄芩、槐米、甘草、夏枯草、珍珠、朱砂、牛黄、冰片22味中药组成，具有行气化瘀、通脉活络等功效，用于防治高血压与脑血管意外，治疗冠状动脉性心脏病引起的心绞痛等病症。处方中丹参具有活血祛瘀、清心除烦、通经止痛、凉血消痈等功效。因原标准中未收录含量测定，为了更好的提高和完善该品种的质量标准，故现采用高效液相色谱法，以丹酚酸B为定量指标，建立了脉络通中丹参的含量测定方法。该检测方法准确性、简便性、可行性及专属性均较好，可作为该品种的质控手段之一。

1 仪器及试药

SHIMADZU(岛津)LC－2010 CHT高效液相色谱仪。丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所，批号111562－200706，供含量测定用，含量以98.0%计)，脉络通(批号A060004、A060005、D060007、C060006、A060003、D060008，赭石包衣;080001，薄膜包衣;药品规格:0.4 g/片)，乙腈、甲醇均为色谱纯，甲酸为分析纯，水为去离子水。

2 方法及结果

2.1 色谱条件Agilent ZORBAX SB－C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)色谱柱;以乙腈－甲醇(10∶30)为流动相A，以甲酸－水(1∶59)为流动相B，按表1进行梯度洗脱;检测波长为286 nm;流速:1.0 ml/min;柱温:40℃;理论板数按丹酚酸B峰计算为8 760，分离度2.1。

表1 _丹酚酸B梯度洗脱系统

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75%甲醇配制成每1 ml含30 μg的对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备取本品，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 ml，密塞，称重，超声处理30 min，放冷，再称重，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，即得。

2.2.3 阴性溶液制备按处方配制诸药，取除丹参以外的其他药材，按该品种制备工艺，制得阴性样品，再按供试品溶液制备方法制得阴性溶液。

2.3 系统适用性分别精密吸取对照品、供试品及阴性溶液各10 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析，结果表明阴性无干扰，结果见图1。

2.4 线性关系的考查取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加75%甲醇制成每1 ml各含0.002 987、0.014 94、0.029 87、0.044 81和0.059 74 mg五种浓度的溶液，精密吸取五种浓度溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。计算标准曲线方程:Y= 1．191 3×106X－2．093 7(r=0．999 9)。结果丹酚酸B对照品在0.029 87～0.597 4 μg之间，线性关系良好。

2.5 重复性试验取本品(批号为D060007)的样品，共6份，按照“2.2.2”项下供试品溶液的方法制备，依照“2.1”项下色谱条件分析，测定每份样品溶液中丹酚酸B含量。结果显示样品中丹酚酸B平均含量为0.687 8 mg/g，RSD为1.5%。

图1 丹酚酸B对照品(A)供试品(B)阴性对照(C)HPLC色谱图

2.6 稳定性试验取重复性试验中的1份样品，分别在0、3、6、9和12 h按“2.1”项下色谱条件分析进样，测得供试品溶液中丹酚酸B峰面积RSD为0.74%。表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.7 精密度试验取重复性中的1份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，连续进样6次，测定样品中丹酚酸B峰面积RSD为0.54%。

2.8 加样回收率试验取本品(批号为D060007)6份，各1 g，精密称定，精密加入对照品溶液(浓度为0.014 89 mg/ml)50 ml，再按“2.2.2”项下供试品溶液的操作方法制成回收用供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，求得平均回收率为100.83%，RSD为2.03%，结果见表2。

表2 _加样回收试验测定结果(n=2)

2.9 样品的测定分别取7批样品，依照“2.2.2”项下供试品溶液制备方法操作，再按“2.1”项下色谱条件分析，测定结果见表3。

表37 批样品含量测定结果(n=6)

3 讨论

3.1 波长及流动相的选择采用紫外分光光度计扫描丹酚酸B对照品溶液，该对照品在286 nm处有最大吸收，与文献［1］报道的波长基本一致。采用《中国药典》中丹参品种项下的流动相进行试验，发现100 min后还有杂质峰，且所测的丹酚酸B峰与其他杂质峰分离度较差，故对流动相进行了适当的改进，采用梯度洗脱的方式，既节省分析时间又有效改善了分离度，同时理论板数亦达到要求。

3.2 提取方法的考查

3.2.1 提取时间考查分别超声处理15、30及60 min。结果显示，超声处理30 min提取的丹酚酸B含量较高，60 min提取含量反而下降，可能是由于丹酚酸B结构不稳定造成，故确定提取时间为30 min。

3.2.2 提取溶剂考查比较了水、50%甲醇、75%甲醇和甲醇四种提取溶剂。75%甲醇提取结果高于其他三种溶剂，故提取溶剂确定为75%甲醇。

3.2.3 提取方式考查采用超声处理与加热回流两种提取方式处理样品，结果超声提取的含量高于加热回流，故提取方式确定为超声处理。

3.2.4 溶剂量考查精密加入75%甲醇25、50和100 ml三种不同溶剂量。结果显示，提取溶剂量为50 ml与100 ml测得丹酚酸B的含量RSD为0.78%，故将提取溶剂量确定为50 ml。

3.3 耐用性试验分别使用安捷伦ZORBAX SBC18(250 mm×4.6mm，5 μm)色谱柱、迪马C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱、菲罗门C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，测定样品中丹酚酸B含量，三者的RSD为0.54%。由此可见不同色谱柱对测定结果基本无影响。结果见表4。