地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞凋亡的影响

裴志勇，赵玉生，高伟，尹巧香

（1.北京军区总医院干部病房一科，北京 100700；2.解放军总医院老年心血管病研究所；3.空军总医院干部病房心内科）

地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞凋亡的影响

裴志勇1，赵玉生2，高伟2，尹巧香3

（1.北京军区总医院干部病房一科，北京 100700；2.解放军总医院老年心血管病研究所；3.空军总医院干部病房心内科）

目的探讨地黄低聚糖（RGOs）对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞（ASCs）凋亡的影响。方法过氧化氢（200μM）联合血清饥饿（H2O2／SD，6 h）建立小型猪ASCs凋亡模型。RGOs（0.01 g／L、0.1 g／L、1 g／L、10 g／L）预处理12h并继续干预6 h。Annexin V-FITC／PI检测细胞凋亡率，CCK-8法测定细胞活性，酶标仪比色法测定细胞caspase-3的活性。结果RGOs在一定浓度范围（0.1～10 g／L）可以减轻H2O2／SD引起的ASCs损伤，表现在细胞凋亡率下降，细胞活性增加，caspase-3活性降低。结论地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导的脂肪组织来源干细胞的凋亡具有保护作用。

干细胞；细胞凋亡；地黄属；猪

干细胞移植治疗急性心肌梗死是心血管再生领域研究的热点，但由于心肌缺血、缺氧造成的氧化应激环境（活性氧蓄积、营养物质缺乏）可致心肌细胞及移植干细胞大量凋亡，严重阻碍了干细胞移植疗效的发挥。可见，改善局部心肌恶劣的微环境是减少心肌细胞凋亡，提高干细胞存活率的关键所在。地黄低聚糖（RGOs）系从地黄中分离提取的一种多糖成分，其在血液、内分泌、免疫系统等方面具有广泛的药理作用，但对于其是否具有抗凋亡作用研究较少。本研究拟采用过氧化氢（H2O2）联合血清饥饿（SD）模拟AMI后局部心肌氧化应激的微环境，诱导体外培养的小型猪ASCs损伤，观察不同浓度RGOs对ASCs凋亡的影响。

地黄低聚糖对过氧化氢-血清饥饿诱导随脂肪组织来源千细胞凋亡随影响

图1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

1 材料与方法

1.1 材料 L-DMED培养基、特级胎牛血清（FBS）、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶均购自Gibco公司，DispaseⅡ中性蛋白酶、Hoechst 33258购自Sigma公司，小鼠抗CD31、CD90单克隆抗体均购自BD PharmingenTM公司，小鼠抗CD29、CD45、CD105、HLA-DR单克隆抗体、大鼠抗CD44单克隆抗体均购自Abcam公司，大鼠抗CD34单克隆抗体购自Santa cruz公司。30%过氧化氢溶液购自北京化工厂，多聚甲醛购自天津市光复精细化工研究所，Ho-echst 33258购自Sigma公司，Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒、罗丹明123、CCK-8试剂盒、Caspase-3活性检测试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒均购自江苏碧云天生物技术研究所。广西巴马小香猪，雌雄不拘，体质量20 kg～30 kg，由解放军总医院实验动物中心提供，许可证号：SYXK（军）2007-009。二氧化碳孵箱（美国Thermo scientific公司），普通光学显微镜（德国Leica DM IL），倒置相差显微镜（日本Olympus BX51），荧光显微镜（德国Leica DM IRB），流式细胞仪（美国Bec km an Coulter CYTOMICSFC 500），低温离心机（美国Sigma 3K18），紫外线分光光度计（美国Bec km an），酶标仪（上海Multiscan MK3）。

1.2 方法

1.2.1 小型猪ASCs的分离与培养 无菌条件下取小型猪腹股沟区脂肪组织5～8 g，冰PBS冲洗3次，去除血污、筋膜及血管，剪碎呈糊状；加入20 mL消化液（L-DMEM＋0.1%Ⅳ型胶原酶＋0.1%DispaseⅡ中性蛋白酶＋0.1%胰蛋白酶），置于37℃孵箱振荡消化40～60 min；加入等量含10%FBS的L-DMEM培养基终止消化，100目、200目筛网过滤，600 g离心6 min；弃上清，加入含10%FBS的L-DMEM培养基重悬细胞，移入培养皿，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。24 h后首次换液，随后每2～3天换液1次。约1周细胞融合80%～90%，加入0.25%胰蛋白酶＋0.04%EDTA溶液消化、传代。倒置显微镜观察原代及传代的ASCs形态学特点。

1.2.2 小型猪ASCs的分子表型鉴定 取第4代细胞，0.25%胰蛋白酶＋0.04%EDTA溶液消化后PBS重悬细胞并计数，细胞密度调至1×106／mL；取9只EP管，分别加入0.5 mL细胞悬液，1000 r／min离心5 min，PBS清洗两遍；0.5 mL PBS再次重悬细胞，加入以下抗体：CD29-FITC、CD31-PE、CD34（一抗）、CD44-FITC、CD45（一抗）、CD90-FITC、CD105-FITC、HLA-DR-FITC（对照加入20μl PBS），混匀后4℃冰箱静置30 min；1900 r／min离心8 min，弃上清；CD34及CD45两只EP管的细胞再次用0.5 mL PBS重悬，加入二抗（均为FITC），混匀后4℃冰箱静置30 min，1900 r／min离心8 min，弃上清；各管均加入2%多聚甲醛0.5 m L，4℃固定30 min。流式细胞仪进行阳性细胞计数，每次分析获取2×104个细胞，Cell Quest软件进行数据分析。实验重复3次。

1.2.3 实验分组 取同一代ASCs，待细胞融合70%～80%时随机分为以下6组：①对照组（Control），无特殊干预；②RGOs 0 g／L＋H2O＋2／SD＋；③RGOs 0.01 g／L＋H2O＋2／SD＋；④RGOs 0.1 g／L＋H2O＋2／SD＋；⑤RGOs 1 g／L＋H2O＋2／SD＋；⑥RGOs 10 g／L＋H2O＋2／SD＋。对照组继续正常培养，其余分组提前加入不同终浓度的RGOs预处理12 h，其后均更换无血清L-DMEM培养基，同时加入相同预处理浓度的RGOs及终浓度为200μM的H2O2（该浓度根据H2O2／SD凋亡模型建立时而定）［1］。作用6 h后收集细胞进行相关检测。

1.2.4 细胞核形态学观察 各组细胞弃上清液，PBS清洗两遍，4%多聚甲醛固定30 min。弃固定液后PBS清洗两遍，加入终浓度为5μg／m l Hoechst 33258染色液，室温30 min。荧光显微镜下观察各组细胞核染色质形态学变化，判断细胞凋亡情况并计数，计算细胞凋亡率。即高倍视野（×400）各组计数至少300个细胞，细胞凋亡率＝凋亡细胞数／细胞总数×100%。实验重复3次。

1.2.5 细胞活性检测 取同一代ASCs细胞种植于96孔板，待细胞融合70%～80%时随机分为6组（同“1.2.3”分组），进一步处理方法“1.2.3”，同时设单纯无血清L-DMED为空白对照，每组设5个复孔，终止培养后，每孔加入10μL CCK-8试剂，置于37℃、5%CO2培养箱继续孵育2 h，酶标仪测定各孔OD450值。各组取5孔OD值的平均数，减去空白对照平均OD450值作为各组实测值，按公式计算细胞存活率，细胞存活率（%）＝处理组实测OD450／对照组实测OD450×100%。实验重复3次。

1.2.6 细胞膜磷酯酰丝氨酸（PS）及线粒体内跨膜电位检测 收集各组细胞，分为两份，一份用400 μL PBS重悬，加入终浓度为1μM罗丹明（Rhodamine）123，37°C孵育30 min，流式细胞仪检测线粒体膜电位；另一份细胞PBS重悬后1000 g离心5 min，弃上清；加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10min；1000 g离心5 min，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；加入10μL碘化丙啶（PI）染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5 min；加入200μL PBS后流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡（Annexin V＋／PI-）、晚期凋亡（Annexin V＋／PI＋）及死亡率（Annexin V-／PI＋），细胞计数2×104。实验重复3次。

1.2.7 Caspase-3活性检测 根据试剂盒说明测定4-硝基苯胺（p NA）的标准曲线。收集各组细胞，PBS洗涤一次，吸尽上清；按照每1×106细胞加入50μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min，4℃18 000 g离心15 min；把上清转移到冰浴预冷的离心管中，根据试剂盒设置反应体系测定caspase-3的酶活性。37℃孵育60～120 min，酶标仪上测定各孔405 nm波长光密度值（OD405）。每组重复3孔，取平均值作为该组OD405，根据标准曲线计算各组p NA含量，即该组caspase-3的酶活力单位数。另取10μL上清液Bradford法测定各样品中蛋白浓度，计算出单位质量蛋白中所含的caspase-3的酶活力单位数。caspase-3活性＝各组caspase-3酶活力单位数／对照组caspase-3酶活力单位数。实验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计学软件进行分析。多组之间比较先采用F检验，后采用q检验。

2 结果

2.1 小型猪ASCs形态学观察 原代细胞接种24 h后首次换液，可见大量贴壁细胞，多呈圆形或椭圆形，少数呈梭形、三角形或多角形，有粗大突起，核居中，细胞质内可见大量大小不等透明圆泡及细小颗粒。72 h后，细胞较前伸展变大，形状如前。7 d左右细胞融合达80%～90%，可按1∶3传代。传代后的细胞数小时可完全贴壁，生长较迅速，5 d左右可再次传代。2～3次传代后细胞多呈三角形、多角形或星形。

2.2 ASCs表面抗原表达 第4代ASCs表面抗原表达率如下：CD29［（99.07±0.28）%］、CD44［（98.83±0.56）%］、CD90［（97.60±0.44）%］、CD105［（99.31±0.48）%］、CD31［（1.95±0.05）%］、CD34［（2.33±0.37）%］、CD45［（1.94±0.04）%］、HLA-DR［（0.35±0.02）%］。提示第4代ASCs表面抗原CD29、CD44、CD90、CD105均呈阳性表达，而CD31、CD34、CD45、HLA-DR均呈阴性。

2.3 细胞凋亡核形态学变化及凋亡率 根据荧光显微镜下细胞核染色质形态学变化计算出各组细胞凋亡率分别为：（6.4±0.7）%，（24.9±3.6）%，（18.2±3.5）%，（11.6±3.3）%，（11.5±3.2）%，（15.6±3.1）%。统计分析显示，单纯H2O2／SD组（RGOs 0 g／L）细胞凋亡率明显多于对照组（P＜0.01），RGOs不同浓度组（0.01～10 g／L）细胞凋亡率较单纯H2O2／SD组均有不同程度下降（P＜0.05～0.01）；其中0.1 g／L组及1 g／L组细胞凋亡率最低。

2.4 细胞活性检测 以对照组为参照，计算出0～10mg／mL不同浓度RGOs组细胞存活率分别为：（52.4±4.2）%，（56.1±5.2）%，（74.3±6.8）%，（84.3±5.7）%，（79.7±7.8）%。统计分析发现，单纯H2O2／SD组细胞存活率低于对照组（P＜0.01），RGOs0.1～10mg／mL组细胞存活率较单纯H2O2／SD组均有显著提高（P＜0.01），而0.01mg／mL组细胞存活率较单纯H2O2／SD组无明显提高。

2.5 膜联蛋白V法（Annexin V）检测细胞凋亡

如图1所示流式细胞仪所测各组细胞凋亡及坏死。以H2O2／SD＋RGOs各组与对照组细胞早期凋亡率（Annexin V＋／PI-）、晚期凋亡率（Annexin V＋／PI＋）及坏死率（Annexin V-／PI＋）的比值作为各组凋亡指数及坏死指数（表1）。统计分析显示，单纯H2O2／SD组细胞早期凋亡、晚期凋亡及坏死指数均明显高于对照组（P＜0.01）；不同浓度RGOs干预后，0.1 g／L、1 g／L、10 g／L三组细胞早期凋亡、晚期凋亡及坏死指数均明显低于单纯H2O2／SD组（P＜0.05～0.01）；而0.01 g／L组以上各指标无明显下降，且均高于对照组（P＜0.05～0.01）。

2.6 Caspase-3活性检测 以H2O2／SD＋RGOs各组（0 g／L、0.01 g／L、0.1 g／L、1 g／L、10 g／L）与对照组caspase-3酶活力单位数的比值作为各组caspase-3活性。各组caspase-3活性依次为：1±0、3.36±0.29、3.12±0.27、1.98±0.14、1.84±0.1、1.97±0.13。统计分析显示，单纯H2O2／SD组caspase-3活性明显高于对照组（P＜0.01）；不同浓度RGOs干预后，0.1～10 g／L组caspase-3活性均明显低于单纯H2O2／SD组（P＜0.01），而0.01 g／L组caspase-3活性无明显下降（P＞0.05）。

3 讨论

细胞凋亡时发生独特的形态学变化，如核染色质凝聚、边集，细胞膜的发泡现象及凋亡小体形成。本研究在荧光显微镜下观察到了H2O2／SD诱导ASCs凋亡时典型的核形态学变化，并根据Hoechst 33258染色后细胞核染色质的变化进行凋亡细胞计数，判断不同浓度RGOs对H2O2／SD损伤的影响。结果显示0.1 g／L、1 g／L及10 g／L浓度组ASCs凋亡率明显下降，提示RGOs具有抗H2O2／SD引起的细胞凋亡作用，最适浓度是0.1～1 g／L。初步证实RGOs具有抗凋亡作用。

表1 各组凋亡指数、坏死指数比较（s）

表1 各组凋亡指数、坏死指数比较（s）

注：与对照组比较，aP＜0.01，bP＜0.05；与0 g／L比较，cP＜0.01，dP＜0.05

组别培养皿数（个）早期凋亡指数晚期凋亡指数坏死指数对照组1±0 1±0 1±0 RGOs 0 g／L 3 3.61±0.77a3.64±0.88a3.89±1.06aRGOs 0.01 g／L 3 2.71±0.52b2.9±0.31a2.81±1.06bRGOs 0.1 g／L 3 1.83±0.62c1.91±0.47c1.90±0.45dRGOs 1 g／L 3 1.65±0.36c1.74±0.20c1.58±0.09cRGOs 10 g／L 3 2.05±0.56d2.14±0.37c2.08±0.31 3 d

Annexin V联合碘化丙啶（PI）检测法可将细胞分为正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞［2］。正常细胞Annexin V及PI均为阴性，而凋亡细胞呈Annexin-V强阳性、PI阴性或弱阳性，坏死细胞则呈Annexin-V阴性或弱阳性、PI强阳性［3］。本研究应用Annexin V-FITC／PI法对细胞凋亡进行了检测，结果显示，0.1～10 g／L浓度的RGOs干预后可明显减少细胞早期凋亡、晚期凋亡及坏死，与形态学观察的结果相符，进一步证明RGOs具有抗凋亡作用。

Caspase家族在介导细胞凋亡过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3是关键的执行分子，在凋亡信号传导的多种途径中发挥功能［4］。通常caspase-3以酶原的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活。因此，caspase-3常被用作早期细胞凋亡的指标。活化的caspase-3由两个大亚基和两个小亚基组成，可裂解相应的胞浆、胞核底物，最终导致细胞凋亡［5］。利用活化的caspase-3可以催化某些底物（Ac-DEVD-p NA、Ac-DEVD-AMC）的特性，通过检测其催化产物的吸光度（p NA）或荧光强度（AMC）可以间接反映caspase-3活化的情况，从而可鉴定细胞凋亡的发生［6］。本研究发现H2O2／SD可显著增加ASCs caspase-3的活性，而给予不同浓度RGOs干预后，caspase-3的活性均有不同程度的下降，最佳作用浓度为0.1～1 g／L。进一步证实具有抗H2O2／SD引起的细胞凋亡作用。

地黄多糖具有补血、降血糖、抗肿瘤、增强免疫及保护心脑组织避免ATP耗竭和缺血损伤的作用。RGOs系从地黄多糖中进一步分离提取的有效成分，对于地黄及其组分抗氧化损伤的机制国内外学者也进行了研究［7-10］。本研究发现，RGOs可以减轻H2O2／SD所致ASCs的凋亡，表现在不同浓度RGOs处理后ASCs活性增加，细胞凋亡率下降，其作用机制可能与RGOs降低caspase-3活性有关，即RGOs可能通过抑制内源性凋亡通路中的线粒体途径来发挥抗凋亡作用。本研究还发现，不同浓度RGOs抗ACSs凋亡的作用不同，其抗凋亡作用主要集中在0.1～1 g／L之间，而低浓度（0.01 g／L）及高浓度（10 g／L）组抗凋亡作用弱或引起凋亡加重，其原因可能与中药的双向调节作用有关。

（本文图1见插图5-1）

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Effect of rehmannia glutinosa oligosaccharides on hydrogen peroxide combined serum deprivation-induced apoptosis in adipose tissue-derived stem cell

PEIZhiyong*，ZHAOYusheng，GAOWei，YIN Qiaoχiang（*Department of Geriatric Cardiology，Beijing Military General Hospital，Beijing 100700，China）

ObjectiveTo investigate the effect of Rehmannia glutinosa oligosaccharides（RGOs）on hydrogen peroxide combined serum deprivation-induced apoptosis in adipose tissue-derived stem cells.M ethods An apoptosismodel ofminiswine adipose tissue-derived stem cells（ASCs）was established by hydrogen peroxide and serum deprivation（H2O2／SD）in vitro.RGOs（0.01 g／L，0.1 g／L，1 g／L，10 g／L）were pretreated for 12 hoursand incubated for6 hours.Apoptosis of ASCs was determined by Annexin V-FITC／PI apoptosis kit，and the cell varibility and Caspase-3 activity was detected by CCK-8 assay and caspase-3 assay kit，respectively.Resu lts RGOs significantly attenuated hydrogen peroxide combined serum deprivation-induced ASCs apoptosis，with a decreased apoptosis rate and caspase-3 activity，an increased cell varibility.Conclution RGOs has a protective effect on hydrogen peroxideand serum deprivation-induced apoptosis of adipose tissue-derived stem cells.

Stem Cell；Apoptosis；Hydrogen peroxide；Rehmannia；Swine

R329.25

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.05.025

2014-01-09）

国家高科技研究发展计划（2006AA02A105）

裴志勇，博士，副主任医师，Email：peizy6618222＠sina.com