埃他卡林对内皮素⁃1诱导的原代培养人肺动脉内皮细胞eNOSmRNA和蛋白表达水平的影响

梅宏波 左祥荣 严星

埃他卡林对内皮素⁃1诱导的原代培养人肺动脉内皮细胞eNOSmRNA和蛋白表达水平的影响

梅宏波 左祥荣 严星

目的研究新型ATP敏感性钾通道（KATP）开放剂埃他卡林（IPT）对内皮素⁃1（ET⁃1）诱导的原代培养人肺动脉内皮细胞（HPAECs）内皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA和蛋白表达水平的影响。方法原代培养HPAECs，对照组不予干预，实验组分别加入ET⁃1，ET⁃1＋IPT、KATP开放剂吡那地尔（PIN）或KATP阻断剂格列本脲（GLI）等孵育。用RT⁃PCR技术，分析各组eNOSmRNA表达；采用Western⁃blot技术，分析各组eNOS蛋白表达。结果ET⁃1使HPAECs eNOSmRNA和蛋白表达水平下调。IPT呈浓度依赖性抑制ET⁃1的作用。GLI逆转IPT的作用。结论长期低氧导致肺血管内皮细胞功能障碍，一氧化氮（NO）生成减少、eNOSmRNA和蛋白水平表达下降，而IPT可改善内皮细胞功能障碍，增加eNOS的表达和NO的释放，从而降低肺动脉压力，可能成为较有前途的治疗肺动脉高压（PAH）的新型化合物。

埃他卡林；内皮素⁃1；KATP通道；人肺动脉内皮细胞

低氧性肺动脉高压（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是指正常人移居高原后，由于缺氧，引起肺小动脉功能及器质性改变，从而导致肺动脉压力增高的病症［1］。

研究发现血管内皮细胞产生的一氧化氮（NO）在HPH的发生机制中起重要调节作用。NO是一种气体分子，通过舒张血管、抑制血小板聚集和白细胞黏附、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制内皮素⁃1（ET⁃1）分泌、清除氧自由基等多种途径抗肺动脉高压（PAH）。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是NO合成中重要的限速酶，通常将NOS分为3型：内皮型（eNOS或NOS3）、神经型（nNOS或NOS1）和诱生型（iNOS或NOS2）［2⁃3］。长期低氧可导致eNOS基因和蛋白的表达水平下调。王慧等［3］研究发现具有我国自主知识产权的新型KATP开放剂埃他卡林（iptakalim，IPT）可拮抗长期低氧诱导的大鼠肺组织eNOSmRNA和蛋白表达下调。

本研究应用逆转录⁃聚合酶链反应（RT⁃PCR）和Western⁃blot技术，进一步了解IPT对ET⁃1诱导的原代培养人肺动脉内皮细胞（HPAECs）eNOSmRNA和蛋白表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂 ET⁃1（Sigma公司）和IPT（军事医学科学院药理和毒理研究所研制合成）生理盐水配制；格列本脲（glibenclamide，GLI，Sigma公司，美国）生理盐水配制后再用氢氧化钠10μmol／L滴定pH值为8.5；吡那地尔（pinacidil，PIN，Sigma公司），二甲基亚砜和生理盐水按1∶3配制；胎牛血清（FBS）（GIBCO公司），M199（GIBCO公司），内皮细胞生长因子（Sigma公司），RNA Trizol试剂（Invitrogen公司）；DEPC（Sigma公司），逆转录试剂盒（TakaRa公司）；2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker（北京天根生化科技有限公司）；Rotor⁃Gene 3000 PCR仪（Corbett Research，Syd⁃ney，Australia）；eNOS一抗为多克隆兔抗人抗体（Bio⁃world Technology Inc），二抗为辣根酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（H＋L）多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），内参为HRP标记的单克隆鼠抗人GAP⁃DH抗体（上海康成生物公司）。预染蛋白Marker（New England Biolab公司），ECL发光液（Cell Signaling Technology）。RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均为南京碧云天产品。

1.2 方法

1.2.1 原代培养HPAECs：在无菌条件下取因各种原因行肺叶切除术的非肺动脉高压患者肺叶（经医院医学伦理委员会批准及患者知情同意），分离肺动脉，立即置入磷酸盐缓冲液（PBS）（NaCl 138.0 mmol／L，KCl 5.0mmol／L，Na2HPO40.3mmol／L，KH2PO40.3mmol／L，NaHCO34.0 mmol／L，青霉素105 U／L和Streptomycin 100 mg／L）。冲洗干净去除红细胞，无菌镊翻转肺动脉使内膜朝外，0.25%胰蛋白酶消化15 min，收集消化液，离心收集细胞，制成细胞悬液按（2～3）×106个／m l接种于含20%FBS的M199培养液的50 ml培养瓶中，37℃5%CO2孵箱（Thermo Scientific Forma公司）培养，每周换液2次，细胞贴壁生长，呈多角形，铺路石样外观；待细胞生长融合＞80%后用0.25%胰蛋白酶消化传代，传代后细胞用含10%FBS的M199培养液培养，取4～6代为实验用细胞。

1.2.2 实验处理及分组：将生长良好的HPAECs从培养瓶消化下来，调整细胞数至1.8×108／L，接种到6 cm培养皿中培养。实验用细胞在不含FBS的M199培养液孵育24 h。根据研究目的进行分组。

1.2.2.1 不同浓度IPT对ET⁃1诱导的eNOSmRNA和蛋白表达水平的影响：对照组A1组（不予干预）；B1组：培养液中加入ET⁃1 10 nmol／L；C1组：培养液中加入ET⁃1 10 nmol／L＋IPT 0.1μmol／L；D1组：培养液中加入ET⁃1 10 nmol／L＋IPT 1.0μmol／L；E1组：培养液中加入ET⁃1 10 nmol／L＋IPT 10μmol／L。B1、C1、D1、E1组分别孵育12 h。

1.2.2.2 GLI对IPT作用的影响：对照组A2组（不予干预）；B2组：培养液中加入ET⁃1 10 nmol／L；C2组：培养液中加入ET⁃1 10 nmol／L＋PIN 10μmol／L；D2组：培养液中加入ET⁃1 10 nmol／L＋IPT 10μmol／L；E2组：培养液中加入ET⁃1 10 nmol／L＋PIN 10μmol／L＋GLI10 μmol／L；F组：培养液中加入ET⁃1 10 nmol／L＋IPT 10 μmol／L＋GLI 10μmol／L。B2、C2、D2、E2、F组分别孵育12 h。

1.2.3 总RNA提取及RT⁃PCR检测：用TRIzol法提取各组细胞总RNA，提取的RNA按照逆转录试剂盒说明操作进行逆转录反应。PCR反应物按照Taq PCR Master Mix反应体系加入。所用引物均由上海细胞生物所合成，加DEPC水溶解，浓度配置成10μmol／L。eNOS上游：5’⁃GAGTCCTCACCGCCTTCTC⁃3’；下游：5’⁃AGGAAGCGGGTGGCAGTA⁃3’，扩增长度为664 bp。GAPDH上游：5’⁃CGGAGT⁃CAACGGATTTGGTCGTAT⁃3’；下游：5’⁃AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC⁃3’，扩增长度300 bp。反应条件：94℃预变性4 min，94℃变性45 s、53℃退火60 s、72℃延伸60 s，共32个循环，最后72℃7min，产物4℃保存。取PCR产物经2%琼脂糖凝胶（含0.5μg／ml溴化乙锭）电泳，紫外灯下观察，拍照。计算eNOS与内对照GAPDH条带灰度比值。

1.2.4 细胞总蛋白提取及Western blot检测：用RIPA裂解液裂解各组细胞，提取总蛋白，用BCA法检测各组蛋白浓度，制备8%SDS⁃PAGE，每泳道加总蛋白量80μg，进行70 V／120 V恒压电泳，经湿转印迹到二氟化树脂（PVDF）膜（Amresco公司），5%BSA⁃TBST洗涤后加5%牛奶（光明牌脱脂奶粉）⁃BSA⁃TBST 37℃封闭1 h，分别加入eNOS兔抗人多克隆抗体（1∶1000稀释）和GAPDH鼠抗人单克隆抗体（1∶5000稀释），4℃孵育过夜，5%BSA⁃TBST洗涤后，GAPDH直接通过ECL化学发光试剂显影；eNOS再加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶10 000稀释），37℃孵育60 min，5%BSA⁃TBST洗涤，ECL化学发光试剂显影。eNOS蛋白相对含量用eNOS／GAPDH灰度比值表示。

1.3 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件对实验结果进行统计学分析，实验数据用均数±标准差（s）表示，各组间差异比较采用方差分析，各实验组间两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ET⁃1对eNOSmRNA和蛋白表达水平的影响 B1组与A1组，B2组与A2组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），10 nmol／LET⁃1抑制eNOSmRNA和蛋白表达，使eNOSmRNA和蛋白表达水平下调。见表1，2。

2.2 不同浓度IPT对ET⁃1诱导的eNOSmRNA和蛋白表达水平的影响 C1、D1、E13组eNOSmRNA和蛋白灰度比值均高于B1组（P＜0.05），IPT呈浓度依赖性抑制ET⁃1诱导的eNOSmRNA和蛋白表达。D2与C2组比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明IPT与KATP开放剂PIN作用相同（表2）。在本实验条件下，IPT 10μmol／L能完全逆转ET⁃1 10 nmol／L所诱导的eNOSmRNA和蛋白表达水平下调，使之恢复至ET⁃1诱导前的水平。见表1，2。

2.3 GLI对IPT的影响 在本实验条件下，eNOS mRNA和蛋白灰度比值，E2组与C2组、F组与D2组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），E2组、F组与B2组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。可见特异性KATP阻断剂GLI可拮抗IPT和PIN对ET⁃1诱导的eNOSmRNA和蛋白表达水平的影响。见表2。

表1 IPT对ET⁃I诱导的eNOS mRNA和蛋白表达的影响（s，n＝3）

注：与A1组比较，∗P＜0.05；与B1组比较，△P＜0.05

组别eNOS mRNA蛋白A1组0.412±0.016 0.462±0.017 B1组0.105±0.006∗0.085±0.004∗C1组0.165±0.010∗△0.156±0.008∗△D1组0.244±0.012∗△0.253±0.012∗△E1组0.408±0.018△0.454±0.016△

表2 GLI拮抗IPT对eNOSmkNA和蛋白表达的影响（s，n＝3）

表2 GLI拮抗IPT对eNOSmkNA和蛋白表达的影响（s，n＝3）

注：与A2组比较，∗P＜0.05；与B2组比较，△P＜0.05

组别eNOS mRNA蛋白A2组0.420±0.016 0.470±0.019 B2组0.114±0.004∗0.102±0.002∗C2组0.410±0.018△0.480±0.020△D2组0.414±0.014△0.476±0.018△E2组0.106±0.002∗0.112±0.003∗F组0.110±0.003∗0.113±0.004∗

3 讨论

目前认为，在肺动脉血流剪切力、缺氧等因素作用下，肺血管平滑肌细胞增殖迁移、细胞外基质（ECM）成分改变、结缔组织不断沉积导致肺血管痉挛、异常生长和重构，最终形成PAH［4］。

NO具有较强的舒张血管和抑制血管平滑肌细胞增殖的作用，内源性NO在血管内皮细胞内经唯一的、关键的限速酶NOS催化L⁃精氨酸而生成。在哺乳动物，NOS有3种亚型即NOS1、NOS2、NOS3，它们分别是不同基因的产物，且有50%～60%的序列同源性［5］。NOS3又称eNOS，为钙依赖性NOS，分子量约为140 kDa，主要表达于血管内皮细胞，通常与膜蛋白相结合以维持血管活性。长期低氧可抑制eNOS基因和蛋白的表达，导致eNOS含量降低，从而使内源性NO的合成和释放减少，促进HPH的发生和发展［6⁃8］。另外，动物实验表明，NO可通过调节TIMP⁃1（基质金属蛋白酶⁃1）／MMP⁃1（基质金属蛋白酶组织抑制因子⁃1）平衡而减少胶原堆积和增加胶原降解来调节高血流所致的肺血管重构［9］。

虽然目前对PAH的发病机制尚未完全阐明，但一致认为ET系统在PAH的发生发展中发挥了重要作用［10⁃11］。ET有4种异构体：ET⁃1、ET⁃2、ET⁃3及血管活性肠收缩肽（VIC）［12］。其中ET⁃1由21个氨基酸残基组成，是目前已知作用最强、持续最久的缩血管活性多肽。并且ET⁃1还能促进肺动脉平滑肌细胞迁移和增殖，导致肺血管重构［13⁃15］。目前ET受体拮抗剂如波生坦已广泛应用于临床，但其价格昂贵，且对ET受体具有非选择性，从而限制了其在临床上的应用。

本研究表明ET⁃1浓度为10 nmol／L时可使eNOS mRNA和蛋白的表达水平下调，从而使内源性NO的合成和释放量减少，促进HPH的发生和发展；新型KATP开放剂IPT呈浓度依赖性地拮抗ET⁃1 10 nmol／L对原代培养HPAECs eNOSmRNA和蛋白表达水平的影响，浓度为10μmol／L时最为明显，并使之恢复到ET⁃1 10 nmol／L诱导前的水平，从而可改善内皮细胞功能障碍，增加eNOS的表达和NO的释放，逆转HPH；特异性KATP阻断剂GLI浓度为10μmol／L时可完全逆转10μmol／L IPT的作用。

IPT是我国学者自行设计与合成的脂肪仲胺类KATP开放剂，为一新型KATP开放剂，此前发现IPT呈浓度依赖性地抑制HPAECs合成分泌ET［11］、抑制ET⁃1诱导的人肺动脉平滑肌细胞外信号调节激酶1和2（ERK1／2）磷酸化［16］、抑制ET⁃1诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖［17］，并且其靶向性较其他KATP开放剂高、不良反应少，有可能成为较有前途的治疗PAH的新型化合物。

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Effects of ip takalim on them RNA and protein expression level of eNOS in p rimary cultured human pulmonary ar⁃terial endothelial cells induced by ET⁃1

MEIHong⁃bo，YAN Xing．DepartmentofRespitory Medicine，the 82nd Hospital of Chinese PLA，Huaian 223001，China；ZUO Xiang⁃rong．ICU，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

ObjectiveTo study the effects of iptakalim，a novel ATP⁃sensitive potassium channel opener，on the mRNA and protein expression level of eNOS in primary cultured human pulmonary arterial endothelial cells（HPAECs）in⁃duced by endothelin⁃1（ET⁃1）.MethodsBy Western⁃blot analysis，the protein expression level of eNOSwasmeasured in primary cultured HPAECs.By RT⁃PCR analysis，themRNA expression level of eNOSwasmeasured in primary cultured HPAECs.The control group received no intervention，and the other groups were incubated with ET⁃1，ET⁃1＋iptakalim，pinacidil or glibenclamide.ResultsThe results demonstrated that ET⁃1 downregulated themRNA and protein expression level of eNOS.Iptakalim inhibited ET⁃1⁃induced downregulation of the mRNA and protein expression level of eNOS in a concentration⁃dependentmanner.Glibenclamide，a selective KATPchannel antagonist，could antagonize the effects of iptakalim.ConclusionsPulmonary vascular endothelial dysfunction is induced by chronic hypoxia，and the level of NO，themRNA and protein expression of eNOS are decreased.Iptakalim can improve the vascular endothelial dysfunction，in⁃crease the expression of eNOS and the level of NO，decrease pulmonary artery pressure and will be a most promising new compound to treat pulmonary arterial hypertension.

iptakalim；endothelin⁃1；KATPchannel；human pulmonary arterial endothelial cells

R 917

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2014.07.020

2013⁃10⁃30）

223001江苏省淮安市，中国人民解放军第八二医院呼吸内科（梅宏波，严星）；210029江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院ICU（左祥荣）