一种激光显微拉曼光谱仪的设计和应用

周 凯 王晓荣 蔡 亮 赵天琦

(南京工业大学自动化与电气工程学院1，江苏 南京 211816;南京灼徽检测技术有限公司2，江苏 南京 211816)

0 引言

将光学显微镜与光纤拉曼光谱仪有机结合的分析方法称为显微拉曼光谱分析法。微区分析是显微拉曼的主要应用范畴。相比于其他传统方法，显微拉曼更容易直接获得大量的物质结构特征［1］。随着显微拉曼技术的日趋成熟，该技术在肿瘤检测、文物考古等领域发挥着重要的作用。

随着显微拉曼技术的发展，拉曼光谱仪在微区分析方面的应用得到了拓宽。显微拉曼应用于微区与表面分析可以获得微区内分子振动信息，从而得到相关分子信息。这种分析方法快速简便、分辨率高，适合微量样品分析。因此，用于样品微区无损分析的激光显微拉曼光谱仪的研究具有十分重要的意义［2－3］。

1 显微拉曼光谱技术的分析基础

当光照射在介质上，除被介质反射、吸收和透射及瑞利散射外，还有一部分与入射光波长不同的散射光，称之为拉曼散射光。光量子与物质分子相互碰撞，可以产生弹性碰撞和非弹性碰撞。在非弹性碰撞过程中，发生了能量交换。光量子不仅改变了运动方向，而且改变了光量子的频率，这种散射现象称为拉曼散射［4］。

拉曼光谱分析的特征量是拉曼频移和散射强度。拉曼频移是拉曼散射光相对于入射光频率的变化量，是非弹性散射最主要的特征量，可以作为拉曼检测中分子结构定性分析的理论基础。拉曼光谱的强度与散射中心(包括基团和化学键)的数目成正比。在入射光的强度保持恒定的条件下，拉曼散射信号强度与待测物质浓度成正比，这正是拉曼光谱法进行定量分析的基础。

拉曼仪器的共焦技术有两种:一种是针孔共焦，又称真共焦;另一种是简单共焦，又称赝共焦［5］。真共焦显微技术的空间分辨率、抑制噪声的能力都强于简单共焦显微技术，但是真共焦对机械稳定性要求很高，生产成本也很高。

根据实际需要，既可以选择高性能、高成本的真共焦方式;也可以在满足设计要求的情况下，选择牺牲一部分空间分辨率的简单共焦方式。

2 激光显微拉曼光谱仪的设计

2.1 显微拉曼的总体设计

显微拉曼光谱仪主要由五个部分组成，分别是激光光源、显微镜采样系统、外光路系统、光谱仪系统和计算机处理系统。新型激光显微拉曼光谱仪的整体测量系统如图1 所示［6－7］。

图1 激光显微拉曼测量系统Fig.1 Laser microscope Raman measurement system

激光光源的作用是提供单色性好、功率大、稳定性强的入射光。显微镜采样系统实现两个功能，首先在照明光源为白光时观测待测物质的显微图像(即组成结构)，并找到最佳观测位置;然后切换为激光入射，照射待测样品。外光路系统首先将激光光源的输出信号经过准直、滤光使之转变为平行光引入显微镜，再将反馈回来的拉曼散射信号引向光谱仪。光谱仪系统包括光栅单色器和CCD检测单元。光栅单色器的主要作用是将拉曼散射信号按波长在空间分开，CCD检测单元用于收集前面分开的光信号并转化为电信号。计算机处理系统完成从CCD检测单元中读取采集到的拉曼光谱数据，对获取的原始拉曼光谱数据进行基线去除、求导、噪声滤除等预处理，然后运用已建立的解析校正模型来进行拉曼光谱的定性、定量分析。

2.2 显微镜系统与光路设计

2.2.1 显微物镜的选择

显微物镜是光学显微镜的最重要组成部分，它负责形成原始图像，并发挥核心作用。常用的物镜有三种，一种是消色差物镜，可以校正两种色光产生的色差;另一种是复消色差物镜，其性能远远优于普通消色差物镜，它能够校正三种颜色的光线产生的色差;还有一种是平场物镜，它能够校正场曲，使整个像面为一个平面。这次设计对显微镜的图像并不追求很高的光强，但为了看清样品的内部结构，对图像清晰度有一定的要求，因此我们选择带有常规平场消色差物镜的显微镜［8］。

2.2.2 光学系统的选择

适用于显微拉曼光谱系统的显微镜必须是无限远光场显微镜。与有限远光学系统相比，无限远光学系统中有一段由成像透镜和物镜构成的平行光线空间，这也正是无限远光学系统使用越来越普遍的原因。这段平行光束理论上可以无限延长，因此，根据设计需要，可以加入各种光学附件。这些光学附件包括偏振光分离器、滤色镜等。由于成像光束在平行光束之后，因此在平行光束中添加光学附件不会影响成像质量，大大简化了物镜的设计。

无限远光学校正系统在无限远光学系统的物镜与成像透镜之间加入其他光学附件，成像点的位置不变;而有限远光学系统中，若是增减其他光学附件，会造成成像点的偏移。由此可见，只能选择具有无限远光学系统的显微镜进行切换设计，才能保证目镜和摄像头处的精确成像，而有限远光学系统适用于各个元件固定不变的情况。远光学校正系统示意图如图2所示。

图2 远光学校正系统示意图Fig.2 Schematic diagram of the optical correction system

本次的光源切换装置正是根据无限远光学系统的原理，作为附加光学器件设计安装在物镜与成像透镜之间，只用来改变光的方向，不影响成像点的质量。

2.2.3 显微镜的切换光路设计

基于以上对显微镜无限远光学系统和显微物镜选择的要求，设计了显微镜与外光路的切换光路［9］，其示意图如图3所示。

图3 激光的引入与导出示意图Fig.3 The diagram of laser introduction and export

本次设计采用的是一维空间滤波光路，因此对显微镜的光路设计并不困难。在显微照明光路的末端，增设一面反射率高达99.5%的全反镜和拉杆装置。全反镜以45°角放置在光路中，拉杆装置实现激发光源(激光)和照明光源(卤素灯光)的切换。由于光路的可逆性，样品被激发后产生的拉曼信号经物镜和镜筒后成为平行光，沿原路返回。

2.3 外光路系统的设计

由于散射光与单根光纤耦合效率很低，采用多根收集光纤可以提高散射光与光纤的耦合效率，从而增加拉曼散射信号的收集效率。所以我们采用多光纤探头的设计方案，外光路设计如图4所示。

图4 外光路设计图Fig.4 Design of external optical path

设计的外光路系统主要包括:激发光纤、收集光纤束、准直透镜、前置全息滤光片、反射镜、后置全息滤光片、聚焦透镜。

激发光纤用于将激光器发出的激光引入外光路。我们用准直透镜准直激发光纤射出的激光，使之变为平行光。其中前置全息滤光片用于滤除激光器在产生激光过程中产生的其他波长的激光和谱线，使激光变得纯净，避免其他谱线对拉曼信号的干扰。反射镜用于反射激发激光，使之射向显微镜。后置全息滤光片用于滤除散射信号中的瑞利散射，并使拉曼散射信号通过。聚焦透镜则把拉曼散射信号聚焦，然后用光纤接头SMA905将拉曼散射信号耦合至收集光纤束，导入光谱仪，从而完成对拉曼光谱仪显微系统的外光路部分的设计［10］。

3 激光显微拉曼光谱仪的应用

3.1 微区无损检测

拉曼微区分析技术可进行空间分辨的原位无损检测，为其他现代分析技术所不及。在固体检测方面，该技术起着重要的作用，不需要制备样品，使用非常方便。

选取彩霞石(又称猪肉石)作为样品，在显微光谱仪下所得到的猪肉石的不同区域的拉曼谱图如图5所示。

图5 彩霞石的拉曼谱图Fig.5 Raman spectrum of pork stone

由图5可以看出，两条曲线都有明显的上扬，而且在687点数处有明显的出峰，所以可以判定这块彩霞石为天然质地，非人造石。商家为了美观，在石头表面做过染料处理，因此产生了很强的荧光。

3.2 矿物检测定性分析

拉曼光谱对样品的结构和成分非常敏感，就像人的指纹一样，因此可以用于样品的定性分析。本课题对单一矿物、混合矿物分别进行了测定，通过比较测试结果与标准谱图，可以判定未知样品是何种物质。

单一矿物以萤石举例，所测得的拉曼谱图如图6所示。混合矿物以辉锑矿方解石共生标本为例，样品以及拉曼谱图如图7所示。通过与标准谱图的拉曼谱图比较可知，透明物质为方解石，深色物质为辉锑矿。

图6 萤石的拉曼谱图Fig.6 Raman spectrum of fluorite

图7 混合矿物的拉曼谱图Fig.7 Raman spectrum of mixed mineral

3.3 翡翠鉴定中的应用

在宝石、玉石翡翠的检测鉴定方面，显微拉曼有着不可替代的作用。天然翡翠的产出远远不能满足市场需要，不法商家使用石蜡、环氧树脂等有机高分子材料来填充原石，冒充优质翡翠。本课题对某商场购买的工艺品翡翠做拉曼分析，谱图如图8所示。翡翠拉曼谱图既有天然翡翠的特征谱带，又有石蜡的特征谱带，说明此工艺品中有石蜡填充物存在，并不是优质的天然翡翠。

图8 翡翠拉曼谱图Fig.8 Raman spectrum of emerald

4 结束语

显微拉曼光谱分析技术是一种基于显微技术和拉曼散射效应的非接触式光谱分析技术，具有无破坏、灵敏度高、检测时间短、所需样品少等优点，可以实现对物质的定性、定量分析。该技术已成为分析科学领域的热点研究之一，被广泛应用于材料科学、生物医学、文物考古等领域。

本文首先介绍激光显微拉曼光谱仪的总体结构;然后重点对其显微镜系统与光路设计进行了设计研究;最后，将激光显微拉曼光谱仪应用于彩霞石的微区检测。结果表明，显微拉曼光谱仪的微区检测可以实现样品的定点检测。将拉曼光谱技术用于对矿物检测定性分析和翡翠的鉴定，通过每种矿物和翡翠的特征谱带，可以快速判定矿物的种类和翡翠的真伪。

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