HPLC法测定“长林”系列油茶籽种仁中2个主要黄酮苷含量

李海琳 刘京晶 朱国华 王军峰 潘心禾

（浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地天然药物研发中心1，临安 311300）

（中国农业科学院茶叶研究所茶树资源与改良研究中心2，杭州 310008）

（丽水市林业技术推广总站3，丽水 323000）

（丽水市林业科学研究院4，丽水 323000）

油茶（Camellia oleifera Abel.），系山茶科山茶属植物中油脂含量较高且有栽培经济价值的一类植物的总称[1]，是我国特有的木本油料树种，具有很高的食、药用价值。除水分外，油茶籽种仁主要由油分、淀粉、蛋白质、多糖、多酚类物质、黄酮类化合物、茶皂素和粗纤维组成，还有少量鞣质和灰分[2]。其中，黄酮类物质在抗氧化活性、防止皮肤疾病、增强免疫力和预防心血管疾病等方面具有重要的生物活性与功效，广泛应用于食品、药品、化妆品等产品中[3-5]。通常采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮含量，李姣娟等[6]、姜天甲等[7]分别用此方法测定了油茶叶和油茶籽壳中总黄酮含量；陈诗强等[8]采用三氯化铝比色法测油茶籽中总黄酮含量；李利敏等[9]采用紫外直接测定法测定了油茶蒲中总黄酮含量。本研究从油茶饼粕中自制2种高纯度黄酮苷作为对照品，建立其高效液相色谱含量测定方法。采用正交试验法优化了油茶籽种仁中2个单体黄酮苷的最佳提取工艺，并测定“长林”系列11个油茶品种。本研究的方法和结果为科学评价“长林”系列油茶提供参考，为油茶新品种选育及相关功能性食品或药品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

“长林”系列11个品种油茶种籽均于2011年10月份采自浙江省丽水市油茶种质资源库，剥除果皮和种壳，种仁于60℃干燥箱中烘干，粉碎过10目筛，干燥器中保存。除长林180号外，其余均已通过国家或省级良种审定[10]。

黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ对照品：自制，经面积归一法检测纯度均大于98%；色谱乙腈：美国TEDIA天地试剂公司。

Agilet1200高效液相色谱仪：Agilent公司，含四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器。

1.2 试验方法

1.2.1 油茶籽种仁提取方法的优化

1.2.1.1 提取方式的选择

通过比较油茶籽种仁中黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ的测定结果，发现传统的回流提取法比超声提取法要高，油茶籽种仁脱脂与否对2个主要黄酮苷含量测定结果无显著影响，所以选择不脱脂直接回流提取的方式。

1.2.1.2 提取溶剂的选择

称取油茶籽种仁粉末0.2 g，分别用50%、80%、100%的甲醇，50%、80%、100%的乙醇，50%的丙酮溶液20 mL作提取溶剂，于80℃水浴回流提取1 h，结果表明，50%甲醇溶液作提取溶剂时，黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ含量最高，所以初步选择50%甲醇溶液作为提取溶剂。

1.2.1.3 正交试验的设计

在提取方式和提取溶剂选择的基础上，进行正交试验设计。采用回流提取方式，称取0.2 g长林55号油茶籽种仁粉末于100 mL圆底烧瓶中，选取甲醇浓度、料液比、提取温度、提取时间为影响因素，按照L9（34）正交表设计试验方案进行试验，试验因素水平及编码见表1，运用高效液相色谱仪记录油茶籽种仁提取液中2个主要黄酮苷的峰面积，计算2个黄酮苷的含量并以此作为考察指标，确定2个黄酮苷的最佳提取方法。

表1 因素水平表

1.2.2 2个单体黄酮苷的HPLC含量测定

1.2.2.1 色谱条件

色谱柱：VenusilMPC18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），线性梯度洗脱：0～30 min，5%～30%B；柱温25℃；流速1.0 mL／min，检测波长220 nm；进样量10μL。在此条件下，2种成分的理论塔板数不低于20 000。

1.2.2.2 对照品的制备和鉴定

黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ的结构鉴定：从油茶饼粕中分离出的2个单体黄酮苷，经UV、H-NMR、CNMR、MS等数据分析，与文献[11]比对一致，鉴定为山奈酚-3-O-｛β-D-吡喃葡萄糖基-（1→2）-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1→6）]-β-D-吡喃葡萄糖苷｝（Ⅰ）和山奈酚-3-O-｛β-D-吡喃木糖基-（1→2）-[α-L-吡喃鼠李糖基 -（1→6）]-β-D-吡喃葡萄糖苷｝（Ⅱ），结构式见图1。

图1 黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ结构式

对照品溶液的配制：称取黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ对照品适量，用甲醇配成质量浓度分别为0.53 mg／mL和0.52 mg／mL的混合溶液，置冰箱中备用。

1.2.2.3 供试品溶液的制备

称取油茶籽种仁粉末0.2 g，置于100mL圆底烧瓶中，精密加入10 mL 80%甲醇，称定质量，于80℃水浴回流提取1 h，放冷称定，补足减失的质量，摇匀，经0.45μm有机微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.2.2.4 线性关系考察

吸取对照品溶液0.5、1、2、4、8、10、15μL注入高效液相色谱仪，依据上述色谱条件进行测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线见表2。

表2 标准曲线和线性范围

1.2.2.5 方法学考察

1） 精密度试验

吸取对照品溶液10μL按1.2.2.1色谱条件重复进样6次。结果表明，黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ峰面积的RSD分别为0.89%和0.76%，表明仪器精密度良好。

2） 稳定性试验

吸取同一供试品溶液10μL，按1.2.2.1色谱条件，依次在0、2、4、6、8、12、24 h进样，结果黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ峰面积的RSD分别为0.37%和0.43%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3） 重复性试验

称取同一批样品（长林3号）6份，分别按2.2.3制备供试品溶液，按1.2.2.1色谱条件测定。结果，黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ峰面积的RSD分别为1.04%和1.07%，表明方法重复性良好。

4） 回收率试验

取0.1 g已知含量的样品9份，精密称定，分别精密加入高、中、低3个剂量的黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ对照品溶液，按1.2.2.1色谱条件进行测定。加样回收率按以下公式计算：

回收率＝（实测量-样品中含量）／加入对照品量×100%

2个对照品成分加样回收率分别为97.3%～98.9%（RSD＜1.95%）和96.8%～98.9%（RSD＜1.55%），结果见表3。

表3 “长林”系列油茶籽种仁中2个单体黄酮苷的加样回收率

2 结果与分析

2.1 正交试验结果与分析

正交试验结果见表4，由表4可知，4个因素对2个黄酮苷含量的影响大小均为：甲醇体积分数＞液料比＞提取温度＞提取时间，并且甲醇体积分数50%，料液比1∶50，提取时间90 min，提取温度80℃时测得2个黄酮苷含量最高。结合方差分析和显著性检验可知，甲醇浓度对黄酮苷提取影响极显著，但在50%和80%水平时差异不显著，考虑到50%提取液略显乳浊状，故甲醇体积分数定为80%；液料比对2个黄酮苷的提取影响极显著，仍定为测得含量最高的1∶50；提取时间对2个黄酮苷的提取影响不显著，故60 min较为合适；提取温度对黄酮苷Ⅰ的提取影响不显著，对黄酮苷Ⅱ的提取影响显著，80℃有利于2个黄酮苷的提取。所以最终确定2个黄酮苷的最佳提取工艺为A2B3C1D2，即甲醇体积分数80%，料液比1∶50，提取温度80℃，提取时间60 min。

表4 正交试验结果

2.2 HPLC含量测定结果与分析

按1.2.2.1色谱条件进行测定，以外标法计算“长林”系列11个不同品种油茶籽种仁中黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ的含量，结果见表5。由表5可知，2个黄酮苷质量分数分别为1.28%～2.98%和1.42%～2.37%，在不同品种油茶中存在显著差异，其中黄酮苷Ⅰ以长林53号、55号和21号最高，长林40号次之，长林23号最低；黄酮苷Ⅱ以长林4号、27号和18号最高，长林23号次之，长林180号、53号最低。油茶籽种仁中总黄酮质量分数为3.57%～4.69%，以长林4号、21号和55号最高，长林18号最低。2个黄酮苷含量呈显著负相关，2个主要黄酮含量的总和分别与2个单体黄酮的质量分数没有显著相关性，可见不能以某一单体黄酮的含量代表该品种油茶籽的黄酮总体含量情况。

由HPLC图（谱图2b）可明显看出油茶籽种仁中最主要的黄酮苷类成分为黄酮苷Ⅰ和黄酮苷Ⅱ，李海琳等[12]前期研究中对油茶籽种仁的总黄酮采用通用的亚硝酸钠-硝酸铝比色法，结果质量分数为0.53%～1.06%，低于本研究HPLC法所测2个黄酮苷含量总和（3.57%～4.71%）。原因是油茶籽种仁中以山奈酚为母核的黄酮苷类化合物不能与亚硝酸钠-硝酸铝试剂反应生成黄色络合物（以黄酮苷Ⅰ标准品溶液进行该显色反应试验，以溶剂为空白对照，在510 nm波长处测定吸光度值约为0），因此，以芦丁为对照品的亚硝酸钠-硝酸铝比色法不能准确定量油茶籽种仁中总黄酮含量。

图2 对照品和油茶籽种仁的HPLC图

3 结论

本研究考察了提取方式（超声提取、回流提取）对2个黄酮苷提取得率的影响，结果表明回流提取的效果明显高于超声提取。继而设计L9（34）正交试验并对结果进行统计学分析，选择80%甲醇溶液，料液比1∶50，温度80℃，回流提取时间1 h为油茶籽种仁中主要黄酮苷的最佳提取工艺。采用Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色谱柱，乙腈 -0.1%磷酸水溶液流动相，线性梯度洗脱，流速1.0 mL／min，检测波长220 nm，柱温25℃，建立了2个主要黄酮苷的HPLC含量测定方法。结果表明11个品种油茶籽种仁中黄酮苷Ⅰ质量分数为1.28%～2.98%，黄酮苷Ⅱ质量分数为1.42%～2.37%。本试验建立的HPLC法专属性强、准确度高、重复性好，可用于油茶品种间黄酮含量的品质评价。

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