苦荞芽粉馒头体外消化后抗氧化能力研究

许芳溢 李五霞 吕曼曼 马雨洁 王 敏

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，杨凌 712100）

苦荞是我国的小宗杂粮作物之一，也是公认的药食同源的食材。苦荞芽是最近兴起的一类广受市场欢迎的绿色蔬菜，因为苦荞经过发芽处理之后，种子内部化学组成发生变化，营养价值提高的同时功能性成分增加，还会产生特殊的风味[1]。研究表明，经过萌发处理的荞麦氨基酸种类增加，含量上升，不饱和脂肪酸的比例增大，生物类黄酮等功能性成分显著增加，抗氧化活性增强[2-4]。馒头是我国的传统主食食品，深受北方居民的欢迎。将苦荞经过萌动处理之后磨制成粉作为辅料添加到日常食用的馒头当中，既能照顾北方居民对馒头的食用习惯，又能满足长期食用苦荞对营养与保健的需求，此外还增加了主食馒头的花色品种，相对于市售的小麦馒头是一个有益的补充。

目前对荞麦制品抗氧化能力的测定方法是基于有机溶剂（甲醇、乙醇或丙酮等）对荞麦进行浸提，得到的提取物用于检测抗氧化活性[5]。但是有机溶剂毕竟有别于人体的生理环境，体外检测的结果往往与生物接受率和利用率的实际效果相差十几倍[6]，并且食品也不可能允许加入甲醇或者乙醇类的提取物。而通过动物或人体试验，不仅昂贵而且受到各种外部因素的制约。因此本研究通过模拟口腔、胃肠消化以及小肠吸收环境，对苦荞芽粉馒头的功能性成分总酚和黄酮以及抗氧化活性进行研究，也为苦荞芽更广泛的应用于新型营养保健食品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料

苦荞：选取具有陕西地区广泛种植并具有代表性的苦荞品种西农9940（西农培育品种）；苦荞芽：苦荞种子经过萌发处理4 d后采收（芽长约为4 cm），50℃烘箱中烘干备用。

荞麦籽粒和苦荞芽经高速万能粉碎机破碎后，用60目的筛子滤掉壳和部分麸皮，剩余的部分即为试验中原料粉。小麦粉：市售聚粮农家面（精品特一粉），安琪高活性干酵母。

1.1.2 试剂

芦丁（质量分数≥98.0%）：国药集团化学试剂公司；没食子酸：科邦生物工程有限公司；Folin-Ciocalteu试剂、DPPH·、ABTS、Trolox、胃蛋白酶，α-淀粉酶、胰蛋白酶、胆汁：sigma公司。

1.1.3 仪器

FX-11型面包发酵箱：广州赛思达机械设备有限公司；FW100型高速万能粉碎机：北京成萌伟业科技有限公司；WFJ72系列721型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 馒头的制作

按照表1所示馒头的配方制成面团，室温静置10 min后放置在37℃，相对湿度为78%的发酵箱中发酵2 h。将发好的面团揉至光滑并整理成圆形后，放入蒸锅中。凉水上锅蒸30 min后取出，室温冷却1 h，备用。按相同的方法制作小麦馒头，作为空白对照。

表1 馒头的配方

1.2.2 体外模拟消化过程

体外模拟消化过程参考Gawlik等[7]的方法，略作修改。

模拟唾液：2.38 g Na2HPO4，0.19 g KH2PO4，8 g NaCl和0.91 gα-淀粉酶（220 U／mL）溶于1 L水中形成模拟唾液，用磷酸盐缓冲液调节溶液pH为6.75。

模拟胃液：0.32% 胃蛋白酶溶于0.3 mol／L的NaCl，HCl调节溶液 pH＝1.2。

模拟肠液：0.05 g胰蛋白酶和0.3 g胆汁溶于35 mL的 NaHCO3（0.1 mol／L）。

体外提取过程（S0）：准确称取6.0 g荞麦馒头样品浸没于100 mL甲醇／水（80／20）溶液中，静置6 h，悬浮液转移至离心管中，2 500 r／min离心10 min，取上清液于45℃水浴下旋转蒸发至干，甲醇重新溶解并定容到10 mL，-20℃保存，备用。

口腔消化过程（S1）：准确称取6 g样品置于100 mL的烧杯中并加入30 mL模拟唾液，均质机搅拌使样品充分破碎均质后放入水浴摇床中，37℃振荡10 min。

胃肠消化过程（S2）：取出水浴摇床中的样品，3 mol／L的盐酸调节溶液体系至pH＝1.5后加入30 mL模拟胃液，置于40℃水浴摇床中振摇60 min。反应结束后取5 mL样液，于70℃水浴锅中灭酶，经过模拟胃部消化的消化液用0.1 mol／L的NaHCO3调节使溶液体系pH为6，加入30 mL胆汁-胰酶的复合液，再分别加入 5 mL 1 mol／L的 NaCl和 1 mol／L KCl，置于37℃水浴震荡120 min模拟肠道消化，于70℃水浴锅中灭酶，-20℃保存备用。每个样品重复3次。

肠道吸收过程（S3）：将20 mL剩余消化液转移到透析袋中，并将透析袋置于装有50 mL PBS缓冲液的烧杯中，37℃水浴震荡4 h。将PBS缓冲液转移到离心管中，-20℃保存备用，每个样品重复3次。

1.2.3 总黄酮含量的测定

采用NaNO2-Al（NO）3络合法测定样品黄酮含量[8]，稍作修改。取消化液 500μL与 500μL 5%NaNO2溶液，漩涡混匀室温下放置6 min，加入500 μL 10%的AlCl3，振荡后静置6 min，再加入2.5 mL 1 mol／L NaOH和1 mL蒸馏水混匀后室温下避光反应15 min，510 nm波长处测定吸光度。以芦丁为标准品制作标准曲线，黄酮含量以mg R／100 g DW（干基）表示（R为芦丁的缩写）。

1.2.4 总酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu法测定试样的总酚含量[9]。取500μL蒸馏水，加入250μL提取液后，再加入250μL Folin-Ciocalteu试剂，充分混匀后加入2.5 mL 7%碳酸钠溶液，漩涡混匀避光放置90 min于760 nm处测定混合液的吸光值。没食子酸为标准品制定标准曲线，多酚含量以mg GA／100 g DW（GA为没食子酸的缩写）。

1.2.5 DPPH·清除能力

清除 DPPH·能力试验参照 Filipcˇev等[10]的方法并稍作修改，以Trolox为标准品，有所调整后进行试验。取1 mL稀释后的馒头提取液，加入1 mL 125.5μmol／L用甲醇溶解的DPPH·溶液 1 mL，迅速混匀避光放置30 min，于517 nm测定混合溶液的吸光值，以相同体积甲醇代替试样，测定其吸光值作为空白对照。清除能力以mmol Trolox／100 g DW表示。

1.2.6 ABTS＋·的清除能力

清除 ABTS＋·能力试验参照 Filipcˇev等[10]的方法并稍作修改，向5 mmoL／L ABTS溶液中加入二氧化锰，并在室温下避光放置30 min后形成ABTS＋·储备液，在734 nm波长下，用pH＝7.4的磷酸缓冲液稀释ABTS＋·溶液至吸光度值为0.7±0.02。500 μL消化液与3 mL ABTS＋·混匀室温下避光反应6 min在734 nm测定吸光度值，以Trolox作为标样制作标准曲线，结果以mmol Trolox／100 g DW表示。

1.2.7 β-胡萝卜素-亚油酸抗氧化体系

参照 Rebey等[11]的方法，并稍作修改。称取β-胡萝卜素2.0 mg、45 mg亚油酸及350 mg Tween-40，用氯仿将其定容到10 mL。取2 mL配好的溶液至圆底烧瓶中，45℃旋转蒸干，100 mL蒸馏水溶解，剧烈震荡30 min以达到氧饱和，形成乳化液。在试管中逐一加入500μL消化液，随后加入3.6mL乳化液，同时设置空白调零管和对照管。抗氧化效果采用 AAC（antioxidant activity coefficient，抗氧化能力系数）来表示。

式中：As（60）为消化液在 t＝60 min时的吸光值；Ac（60）为空白在 t＝60 min时的吸光值；Ac（0）为空白在t＝0 min时的吸光值。

1.2.8 理论研究法

为了更好的理解消化过程中活性物质的生物利用率，定义了以下公式：

活性物质生物利用率（ACPX）＝cX／c0

注：cx为各消化吸收阶段溶液活性物质的浓度（X＝1为口腔消化阶段，X＝2为胃肠道消化阶段，X＝3为小肠吸收阶段），c0为有机溶剂提取的活性物质浓度。

1.2.9 统计方法

各组试验数据均重复3次，所得结果用平均值±标准偏差表示。数据用Excel软件绘制图标，DPS软件进行多重比较，检验的显著水平为0.05。

2 结果分析

2.1 活性物质含量

2.1.1 黄酮含量

小麦、苦荞馒头和苦荞芽粉馒头各个阶段的总黄酮的含量如表2所示。

表2 小麦、苦荞原粉和苦荞芽粉馒头各阶段消化液黄酮含量

由表2可以看出，随着苦荞芽粉含量的增加，馒头消化液各个阶段的总黄酮含量均显著增加。

其中在胃肠道消化液中，芽粉馒头总黄酮显著高于同等比例添加量的苦荞馒头以及小麦馒头。而在苦荞芽粉馒头的消化液中，总黄酮含量由高到低的顺序依次为S2＞S3≈S1，即总黄酮浓度在胃肠道消化之后达到峰值，而在口腔中和吸收后浓度较低。

黄酮的生物利用率结果表明，尽管馒头的甲醇提取液总黄酮含量很高，但在人体的消化环境中含量却非常低，即食品中总黄酮的生物利用效率很低，能够吸收的黄酮类物质更小。相对于对照组的小麦馒头，在馒头加入一定比例（4%～12%）的苦荞芽粉可以明显提高各阶段消化液中黄酮类物质的释放比率，其中胃肠道的消化液生物利用率最高，为3.51%～4.52%，约是小麦馒头的3～4倍；同时黄酮的吸收比率也明显改善，为1.29%～1.43%，是对照组苦荞原粉馒头的7～8倍。

2.1.2 总酚含量

小麦、苦荞馒头和苦荞芽粉馒头各个阶段的总黄酮的含量如表3所示。

从表3中数据可以得到，随着苦荞芽粉含量的增加，馒头的总酚含量呈现上升的趋势，并且在口腔、胃肠道和吸收3个阶段都显著高于苦荞馒头和对照组馒头的总酚含量。与总黄酮的结果类似，各添加量苦荞芽粉馒头的总酚含量在胃肠道消化之后达到最大值（3.74～4.65 mg GA／100 g），而能透过半透膜的酚类物质只占胃肠道的22%～28%。小麦馒头和苦荞馒头的总酚含量在胃肠消化液中也达到峰值（3.07～4.21 mg GA／100 g），但吸收率仅为9%～22%。

表3 小麦、苦荞原粉和苦荞芽粉馒头各阶段消化液总酚含量

总酚的生物利用率结果与总黄酮一致，尽管馒头的甲醇提取液总酚含量很高，但在人体的消化环境中含量却非常低，即食品中总酚的生物利用效率极低，能够吸收的多酚类物质极少。随着苦荞芽粉添加量的增加，虽然各阶段消化液总酚的含量增加，但生物利用率却呈下降的趋势；当添加量达到8%时，馒头总酚在口腔和胃肠道阶段的生物利用率甚至小于小麦馒头和相同比例添加量的苦荞原粉馒头。

2.2 馒头消化液抗氧化能力测定

2.2.1 DPPH·清除能力

小麦、苦荞馒头和苦荞芽粉馒头消化3个阶段的DPPH·清除能力如表4所示。

由表4可知，苦荞芽粉馒头各阶段消化液清除DPPH·能力显著高于苦荞馒头和小麦馒头，并且随着添加量的增加，清除自由基的能力逐渐增加，并且经过胃肠道消化的溶液抗氧化能力最强。当苦荞芽粉的添加量达到12%，馒头胃肠道的消化液清除DPPH·能力最强，为6.20mmol Trolox／100 g DW显著高于相同苦荞粉添加量馒头胃肠道消化液的5.71 mmol Trolox／100 g DW，约是对照组的2.8倍。

2.2.2 ABTS＋·的清除能力

小麦、苦荞馒头和苦荞芽粉馒头3个阶段的ABTS＋·的清除能力如表5所示。

由表5知，苦荞芽粉馒头各阶段消化液清除ABTS＋·能力显著高于苦荞馒头和小麦馒头，且随着添加量的增加，清除自由基的能力逐渐增加，胃肠道消化后抗氧化能力最强。当苦荞芽粉的添加量达到12%，馒头胃肠道的消化液清除ABTS＋·能力最强，分别为4.29 mmol Trolox／100 g DW，显著高于相同苦荞粉添加量馒头胃肠道消化液4.16 mmol Trolox／100 g DW，约是对照组的1.8倍。

2.2.3 β-胡萝卜素亚油酸漂白能力

小麦、苦荞馒头和苦荞芽粉馒头3个阶段的β-胡萝卜素亚油酸褪色能力如表6所示。

表4 小麦、苦荞原粉和苦荞芽粉馒头各阶段消化液清除DPPH·能力／mmol Trolox／100 g

表5 小麦、苦荞原粉和苦荞芽粉馒头各阶段消化液清除ABTS＋·能力／mmol Trolox／100 g

表6 小麦、苦荞原粉和苦荞芽粉馒头各阶段消化液抑制β-胡萝卜素褪色能力

所有试验的馒头消化液中，小麦馒头的抗氧化系数最低，抗油脂氧化的效果最差。苦荞芽粉馒头开始在唾液消化液中抑制β-胡萝卜素褪色的能力较低，显著弱于相同比例添加量的苦荞原粉馒头，但随着消化过程的进行，苦荞芽粉馒头消化液抑制亚油酸漂白能力逐渐增强，胃肠道消化之后抗氧化系数达到最大，为142.26～178.78，显著高于相同梯度的苦荞原粉馒头。在所有样品消化吸收3个阶段中，抗氧化效果由高到低依次为S2＞S3＞S1，苦荞芽粉馒头在吸收阶段中抗氧化系数最低，仅为12.77～15.76。当苦荞芽粉添加量为4%时，吸收液抑制β-胡萝卜素褪色的能力虽然高于小麦，但与相同比例的苦荞原粉馒头相比无显著性差异。

2.3 相关性分析

小麦、苦荞原粉和苦荞芽粉馒头消化液总酚、总黄酮含量与DPPH·和ABTS＋·清除能力关系如表7所示。

表7 小麦、苦荞原粉和苦荞芽粉馒头消化液总酚、总黄酮含量与抗氧化性的相关性

表7的数据显示，小麦、苦荞原粉和苦荞芽粉馒头各阶段消化液总酚、总黄酮含量与 DPPH·和ABTS＋·清除能力呈正相关，其中总酚含量与消化液DPPH·和ABTS＋·清除能力呈极显著相关，说明总酚的含量越高，消化液DPPH·和ABTS＋·清除能力越强。然而，消化液总酚和总黄酮含量与抑制β-胡萝卜素褪色能力相关性并不显著。说明虽然总酚和总黄酮对油脂氧化有一定阻遏作用，但它们在油脂体系中抗氧化的效果相对于其清除DPPH·和ABTS＋·效果稍显不如。

3 讨论与结论

人体内许多生化反应会伴随着自由基的产生，数量过多会与体内脂肪酸、蛋白质等发生反应，破坏相关细胞的功能和结构，引发机体衰老，成为癌症、动脉粥样硬化等疾病的诱因[12]。DPPH·和ABTS＋·是稳定的有色人工自由基，被广泛用于模拟人体自由基和食品抗氧化能力的测定。

苦荞芽粉馒头体外模拟消化后抗氧化性的研究表明，样品经过消化吸收后仍然具有清除DPPH和ABTS自由基的能力，以及抑制β-胡萝卜素褪色的能力，并且随着芽粉添加量的增加，抗氧化性越强。苦荞芽粉馒头的黄酮和多酚含量、抗氧化能力均显著高于相同比例苦荞原粉馒头和对照组的小麦馒头，试验结果与苦荞芽的黄酮和多酚含量高于苦荞种子结论一致[13]，说明可以通过向馒头中添加富含活性物质的苦荞芽粉来提高食品的营养和功能品质。同时，这些活性成分受到消化液和外部化学环境的影响后，会逐渐释放出来，并在胃肠道消化之后达到最大。这是因为在食物的消化过程中，在一系列消化酶的作用下，植物细胞壁会发生破裂或者皱缩，使得储存在细胞内的多酚类物质在消化过程中被缓慢的释放出来[14]。酚类物质通常以糖苷配体或者酯的形式存在，经过胃液的酸性环境时，在较低pH值的作用下会水解释放出大量的自由酚，使得样品的总酚含量在胃肠液提取后显著增加[15-16]。消化液中的活性物质在体内的吸收率却不高，试验结果与Tagliazucchi等[10]报道关于葡萄多酚的生物利用率以及Urszula等[16]报道的洋葱面包体外模拟消化后多酚含量及清除DPPH自由基能力的变化规律是一致的[14，16]。有研究证明，结合态的酚类化合物进入肠道细胞是通过Na＋通道主动运输的方式而自由态的酚类化合物则是通过被动运输途径[17]。试验用透析袋模拟小肠的吸收过程没有消耗能量，所以只包含被动运输方式。苦荞芽粉馒头的黄酮和多酚吸收量显著高于苦荞馒头和小麦馒头，不仅是因为芽粉中的酚类化合物高于原粉，还可能是和芽粉中游离态的酚类物质组成较高有关。然而研究还发现，虽然馒头多酚和黄酮类物质的含量非常高，但是这些活性物质的生物利用率非常低，因为人体消化液的基质是水，而黄酮和多酚类物质多是脂溶性的，所以尽管在酶和pH的作用下消化液的黄酮和酚类物质含量会增加，但人体可利用的活性物质含量较总体来说是极低的。并且，生物利用率会随着苦荞芽粉添加量的增大而减小，这可能是因为溶液中部分游离的黄酮和多酚会与被胰蛋白酶分解的多肽或纤维素结合，降低活性物质的生物利用率[7]。活性物质含量与其抗氧化性有良好的线性关系，其中总酚含量与DPPH·和ABTS＋·清除能力有极显著的相关性，表明酚类物质在食品抗氧化性中起到了巨大的作用，所以由于酚类物质含量的不同，使得各阶段的消化液表现出不同的抗氧化性。萌发是一个逆境生长过程，芽苗为了抵抗外部氧胁迫环境自身合成大量多酚和黄酮[18]，使得芽苗的抗逆性增大，苦荞芽粉馒头抗氧化活性增强。

研究认为，苦荞芽粉可以开发为一种辅料添加到日常食用的馒头当中，对氧化应激引起的慢性非传染性疾病可能具有预防效果[19]。近年来，越来越多的研究证明杂粮中植物化学组分对由氧化应激引起的退行性疾病有很好的预防和治疗作用[20]。研究表明，苦荞富含酚酸和黄酮类化合物，这些活性成分具有防治高血压、冠心病、糖尿病以及抗癌、抗肿瘤等多种功能[21]。然而目前大多关于食品抗氧化性的报道都是采用乙醇或者甲醇作为溶剂提取样品中的活性成分，这样体外测定的结果可能与人体胃肠液作为溶剂提取的效果差异很大[22]。模拟体内环境研究多酚和黄酮类物质的消化和吸收，所得的结果更贴近于真实的生理环境，并且对于探索食品中活性成分的有效浓度有重要的意义，同时为进一步的体内试验提供参考。以上体外研究结果虽然揭示了苦荞芽粉馒头抗氧化能力变化规律的可能性，但是否与体内复杂生理环境下的变化特点保持一致，仍需今后动物实验乃至人体观察的进一步研究。

[1]刘本国，陈永生，高海燕，等.苦荞麦萌发过程中活性成分的变化[J].粮油加工，2010（3）：48-50

[2]Kim S L，Kim S K，Park C H.Introduction and nutritional evaluation of buckwheat sprouts as a new vegetable[J].Food Research International，2004，37（4）：319-327

[3]王学辉，薛风照.苦荞麦萌发过程中营养物质的变化及分布研究[J].2013，11（4）：63-66

[4]张美莉，吴继红，胡小松，等.苦荞和甜荞萌发后脂肪酸营养评价[J].2005，20（3）：44-46

[5]马雨洁，王敏，刘航，等.熟制荞麦面条抗氧化品质及体外淀粉消化特性研究[J].食品科学，2013（17）：83-87

[6]Kim M H，Jo SH，Jang H D，etal.Antioxidantactivity and alpha-glucosidase inhibitory potential ofonion（A.cepaL.）extracts[J].Food Science and Biotechnology，2010，19（2）：159-164

[7]Gawlik-Dziki U，Dziki D，Baraniak B，et al.The effect of simulated digestion in vitro on bioactivity ofwheat bread with tartary buckwheat flavones addition[J].LWT-Food Science and Technology，2009，42（1）：137-143

[8]Ma Y，Guo X，Liu H，et al.Cooking，textural，sensorial，and antioxidant properties of common and tartary buckwheat noodles[J].Food Science and Biotechnology，2013，22（1）：153-159

[9]Guo X D，Wu C S，Ma Y J，et al.Comparison of milling fractions of tartary buckwheat for their phenolics and antioxidant properties[J].Food Research International，2012，49（1）：53-59

[10]Filipcˇev B，Šimurina O，SakacˇM，et al.Feasibility of use of buckwheat flour as an ingredient in ginger nut biscuit formulation[J].Food Chemistry，2011，125（1）：164-170

[11]Rebey Bettaieb I，Bourgou S，Ben Slimen Debez I，et al.Effects of extraction solvents and provenances on phenolic contents and antioxidant activities of cumin（Cuminum cyminum L.）Seeds[J].Food and Bioprocess Technology，2011，5（7）：2827-2836

[12]解温品，秦士新.自由基医学研究进展[J].中华损伤与修复杂志，2012，7（2）：194-196

[13]Kim S J，Zaidul ISM，Maeda T，et al.A time-course study of flavonoids in the sprouts of tartary（Fagopyrum tataricum Gaertn.）buckwheats[J].Scientia Horticulturae，2007，115（1），13-18

[14]Tagliazucchi D，Verzelloni E，Bertolini D，et al.In vitro bio-accessibility and antioxidant activity of grape polyphenols[J].Food Chemistry，2010，120（2），599-606

[15]Gumienna M，Lasik M，Czarnecki Z.Bioconversion of grape and chokeberry wine polyphenols during simulated gastrointestinal in vitro digestion[J].International Journal of Food Sciences and Nutrition，2011，62（3），226-233

[16]Urszula Gawlik-Dziki，Swieca M，Dziki D，et al.Quality and antioxidant properties of breads enriched with dry onion（Allium cepa L.）skin[J].Food Chemistry，138（2-3）：1621-1628

[17]Wiczkowski W，Nemeth K，Bucin＇ski A，et al.Bioavailability of quercetin from flesh scales and dry skin of onion in rats[J].Polish Journal of Food and Nutrition Sciences，2003，12：95-99

[18]Zhou X L，Cheng SN，Yang Y L，etal.Toward a novel understanding of buckwheat self-defensive strategies during seed germination and preliminary investigation on the potential pharmacological application of itsmalting products[J].Journal of Medicinal Plants Research，2011，5（32）：6946-6954

[19]Alvarez P，Alvarado C，Mathieu F，et.al.Dietsupplementation for 5 weeks with polyphenol-rich cereals improves several functions and the redox state of mouse leucocytes[J].European Journal of Nutrition，2006，45（8）：428-438

[20]王红育，李颖.荞麦的研究现状及应用前景[J].食品科学，25（10）：388-391

[21]谭玉荣，陶兵兵，关郁芳，等.苦荞类黄酮的研究现状及展望[J].食品工业科技，2012，24（18）：377-381

[22]乔凤云，陈欣，余柳青.抗氧化因子与天然抗氧化剂研究综述[J].科技通报，2006，22（3）：332-336.