百草枯降解菌的分离鉴定及降解特性研究

韩欣等

摘 要：从沾化百草枯污染土壤中富集、筛选、分离出3株具有百草枯降解能力的菌株，进一步研究了这3株优势菌的生理生化特征及最佳生长条件。通过形态学观察和生理生化指标的测定，对这3株菌种进行鉴定，初步确定：BCK-1为颤螺菌属，BCK-2为梭菌属，BCK-3为芽孢盐杆菌属。这3株菌株在37℃培养3d后，发现这3株菌株（BCK-1，BCK-2，BCK-3）对百草枯的降解率分别为79.35%、80.26%和86.22%。3株优势菌种可应用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢复。

关键词：百草枯降解菌；分离；鉴定

中图分类号 S48 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）08-38-03

Abstract：Three strains were isolated from the Zhanhua paraquat contaminated soil，and optimal growth conditions were further studied on the physiological and biochemical characteristics of the three dominant bacteria. The Determination by morphological observation，physiological and biochemical indicators were identified，these three strains are initially identified BCK-1 Oscillosporia Chatton&Perard，BCK-2 for Clostridium Prazmowski，BCK-3 Sporohalobacter Orenetal. These three strains at 37℃ after 3d found three strains （BCK-1，BCK-2，BCK-3）and the degradation rate of paraquat were 79.35%，80.26% and 86.22%，respectively. The three dominant strain can be applied to paraquat contaminated bacteria source soil biological recovery.

Key words：Paraquat degrading bacteria；Separate；Appraisal

百草枯是一种被广泛使用的人工合成有机农药，具有杀草活性高、选择性强、用量少等优点，已成为滨州地区用量最大的除草剂之一。但在农业生产中广泛应用的同时，百草枯也不可避免的在土壤中残留[1]，从而抑制土壤中微生物的生长，降低土壤的肥力，以及对非靶标的陆上或水生生物产生危害，最终影响农产品质量和人们的身体健康[2]。

随着生物技术的发展，应用微生物降解农药残留具有安全性好、效果好、费用低、处理彻底、无二次污染等优点。利用微生物降解百草枯及修复被污染的土壤[3]，将具有十分广泛的应用前景[4]。目前，国外所报告的对百草枯有降解作用的微生物主要有放线菌、真菌、细菌等，我国关于百草枯降解菌的报道较少，其中在《百草枯降解菌研究初报》中，延安大学高小朋、王海虹、陈彦羽从长期喷施百草枯的土壤中经富集、筛选[5]，得到4株百草枯降解菌。

本研究从滨州沾化百草枯污染的土壤中富集、筛选、分离出3株降解菌株，并且通过形态学观察和生理生化特征的测定对其进行了初步鉴定，同时进一步研究了它们的最佳生长条件和降解特性。

1 材料与方法

1.1 供试材料 菌株来源：滨州沾化百草枯污染土壤；培养基：富集培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、以百草枯为唯一碳源的培养基、全营养培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 菌源的富集 从长期使用百草枯的农田中取土样，富集培养。

1.2.2 百草枯降解菌株的分离[6] （1）制备菌悬稀释液：稀释度到10-5稀释液，待用。（2）分离单菌株：将稀释后的稀释菌液分别涂布到牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃恒温培养48～72h。随后在以百草枯为唯一碳源培养基上划线分离。培养后，挑取单菌落接种于斜面保藏在4℃冰箱中。

1.2.3 菌株降解百草枯 挑取平板上的单菌落按4%的接种量接入以百草枯为唯一碳源的液体培养基[7]，28℃、150r/min条件下振荡培养2d。在相同的培养条件下，设置不接种的以百草枯为唯一碳源的液体培养基作对照。

1.2.4 选出优势菌种并测定降解率 以稀释涂平板法、分光光度计法进行优势菌种培养和降解率的测定。百草枯降解率的计算[8]：百草枯降解率（%）=[（对照浓度-样品浓度）/对照浓度]×100。

1.2.5 优势菌种菌落的形态观察 用放大镜进行观察菌落形状、大小、颜色、光泽度、粘稠度、边缘、隆起状态、透明度等。

1.2.6 优势菌种生理特征的测定 参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]分别从革兰氏染色，运动性测定，芽孢，光镜下观察个体形态、生长温度及耐受性这5个方面进行了测定。

1.2.7 优势菌种生化特征测定 参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]分别从糖发酵实验，甲基红（M.R）实验，V-P实验，吲哚实验这4个方面进行了测定。

1.2.8 优势菌种最适生长条件的测定 （1）测定生长量[11]：用可见光分光光度法测定各温度下菌液的OD值（600nm），确定生长量。（2）测定最适pH、最适温度、最适NaCl浓度、最适百草枯浓度[12]。

1.2.9 菌体生长曲线的测定 按沈萍等[13]方法进行菌体生长曲线的测定。endprint

2 结果与讨论

2.1 优势菌的形态特征、生理生化特征 由表1、2可初步确定，BCK-1为颤螺菌属，BCK-2为梭菌属，BCK-3为芽孢盐杆菌属[14]。

2.2 优势菌种最适生长条件 由图1中各个曲线图可知：BCK-1（颤螺菌属）：最适pH7.4～7.6，最适温度t=20℃，NaCl浓度为3%，百草枯浓度为1.6μL/mL；BCK-2（梭菌属）：最适pH7.4～7.6，最适温度t=28℃，NaCl浓度为3%～5%，百草枯浓度为2μL/mL；BCK-3（芽孢盐杆菌属）：最适pH6.9～7.1，最适温度t=24℃，NaCl浓度为7%，百草枯浓度为2μL/mL。

2.3 优势菌株的降解率 由表3可知，3株优势降解菌降解百草枯的能力较好，降解率均在80%左右，其中BCK-3降解效果优于其他2株菌。

3 结论与讨论

本研究中，从滨州沾化长期使用百草枯的土壤中富集、筛选分离出3株具有百草枯降解能力的菌株，并进一步研究了这3株优势菌的生理生化特征及最佳生长条件。通过形态学观察和生理生化指标的测定，对这3株菌种进行鉴定，初步确定：BCK-1为颤螺菌属，BCK-2为梭菌属，BCK-3为芽孢盐杆菌属。这3株菌株在37℃培养3d后，发现其在实验室条件下对百草枯的降解率分别为79.35%、80.26%、86.22%。可能由于这3株优势降解菌分离自黄河三角洲腹地的盐碱地，具有较强的耐盐能力[15]。因此，这3株优势菌种可应用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢复。

参考文献

[1]吴志凤，秦冬梅.百草枯在土壤中的安全性及残留检测技术简介[J].农药科学与管理，2003，24（3）：8-12.

[2]邓晓，唐群锋.百草枯对土壤微生物影响的研究[J].中国生态农业学报，2006，10（4）：146-149.

[3]郑金来，李君文，晁福寰.常见农药降解微生物研究进展及展望[J].环境科学研究，2001，14（2）：62-64.

[4]阮少江，刘洁，赵永芳，等.微生物降解甲胺磷农药的进展[J].宁德师专学报，2000，12（3）：177-180.

[5]高小朋，王海虹，陈彦羽.百草枯降解菌研究初报[J].湖北农业科学，2011，08（10）：3 302-3 303.

[6]张德涛，曾蕊，杨媚，等.真菌对有机磷农药生物降解的研究进展[J].安徽农业科学，2010，（5）：2 558-2 561.

[7]李春艳，李艳春，成小松，等.一株丁草胺降解菌的分离鉴定及培养条件优化[J].环境科学学报，2010，30（2）：347-353.

[8]魏敏，李玉江.微生物降解土壤残留农药的研究进展[J].山东化工，2007，16（03）：15-17.

[9]东秀珠，蔡妙英，等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.2.

[10]杨革.微生物学实验教程（第1版）[M].北京：科学出版社，2007.

[11]黄绍重.可见光光度法测定Fe（Ⅲ）的研究进展[J].化学世界，2007，4：248-251.

[12]李颖，贾丽娜，张鹏.高效生物修复菌株的筛选及其降解能力的研究[J].化工环保，2004，24（S）：15-17.

[13]沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验（第3版）[M].北京：高等教育出版社，2001.

[14]Cheng HR，Jiang N.Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts[J].Biotechnology Letters，2006，28：55-59.

[15]Karen MK，Sherry LH，Douglas CN.Novel，attached，sulfur-oxidizing bacteria at shallow hydrothermal ventspossess vacuoles not involved in respiratory nitrate accu-mulation[J].Appl Environ Microbiol，2004，70：7 487-7 496.

（责编：张宏民）endprint

2 结果与讨论

2.1 优势菌的形态特征、生理生化特征 由表1、2可初步确定，BCK-1为颤螺菌属，BCK-2为梭菌属，BCK-3为芽孢盐杆菌属[14]。

2.2 优势菌种最适生长条件 由图1中各个曲线图可知：BCK-1（颤螺菌属）：最适pH7.4～7.6，最适温度t=20℃，NaCl浓度为3%，百草枯浓度为1.6μL/mL；BCK-2（梭菌属）：最适pH7.4～7.6，最适温度t=28℃，NaCl浓度为3%～5%，百草枯浓度为2μL/mL；BCK-3（芽孢盐杆菌属）：最适pH6.9～7.1，最适温度t=24℃，NaCl浓度为7%，百草枯浓度为2μL/mL。

2.3 优势菌株的降解率 由表3可知，3株优势降解菌降解百草枯的能力较好，降解率均在80%左右，其中BCK-3降解效果优于其他2株菌。

3 结论与讨论

本研究中，从滨州沾化长期使用百草枯的土壤中富集、筛选分离出3株具有百草枯降解能力的菌株，并进一步研究了这3株优势菌的生理生化特征及最佳生长条件。通过形态学观察和生理生化指标的测定，对这3株菌种进行鉴定，初步确定：BCK-1为颤螺菌属，BCK-2为梭菌属，BCK-3为芽孢盐杆菌属。这3株菌株在37℃培养3d后，发现其在实验室条件下对百草枯的降解率分别为79.35%、80.26%、86.22%。可能由于这3株优势降解菌分离自黄河三角洲腹地的盐碱地，具有较强的耐盐能力[15]。因此，这3株优势菌种可应用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢复。

参考文献

[1]吴志凤，秦冬梅.百草枯在土壤中的安全性及残留检测技术简介[J].农药科学与管理，2003，24（3）：8-12.

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[3]郑金来，李君文，晁福寰.常见农药降解微生物研究进展及展望[J].环境科学研究，2001，14（2）：62-64.

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[6]张德涛，曾蕊，杨媚，等.真菌对有机磷农药生物降解的研究进展[J].安徽农业科学，2010，（5）：2 558-2 561.

[7]李春艳，李艳春，成小松，等.一株丁草胺降解菌的分离鉴定及培养条件优化[J].环境科学学报，2010，30（2）：347-353.

[8]魏敏，李玉江.微生物降解土壤残留农药的研究进展[J].山东化工，2007，16（03）：15-17.

[9]东秀珠，蔡妙英，等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.2.

[10]杨革.微生物学实验教程（第1版）[M].北京：科学出版社，2007.

[11]黄绍重.可见光光度法测定Fe（Ⅲ）的研究进展[J].化学世界，2007，4：248-251.

[12]李颖，贾丽娜，张鹏.高效生物修复菌株的筛选及其降解能力的研究[J].化工环保，2004，24（S）：15-17.

[13]沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验（第3版）[M].北京：高等教育出版社，2001.

[14]Cheng HR，Jiang N.Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts[J].Biotechnology Letters，2006，28：55-59.

[15]Karen MK，Sherry LH，Douglas CN.Novel，attached，sulfur-oxidizing bacteria at shallow hydrothermal ventspossess vacuoles not involved in respiratory nitrate accu-mulation[J].Appl Environ Microbiol，2004，70：7 487-7 496.

（责编：张宏民）endprint

2 结果与讨论

2.1 优势菌的形态特征、生理生化特征 由表1、2可初步确定，BCK-1为颤螺菌属，BCK-2为梭菌属，BCK-3为芽孢盐杆菌属[14]。

2.2 优势菌种最适生长条件 由图1中各个曲线图可知：BCK-1（颤螺菌属）：最适pH7.4～7.6，最适温度t=20℃，NaCl浓度为3%，百草枯浓度为1.6μL/mL；BCK-2（梭菌属）：最适pH7.4～7.6，最适温度t=28℃，NaCl浓度为3%～5%，百草枯浓度为2μL/mL；BCK-3（芽孢盐杆菌属）：最适pH6.9～7.1，最适温度t=24℃，NaCl浓度为7%，百草枯浓度为2μL/mL。

2.3 优势菌株的降解率 由表3可知，3株优势降解菌降解百草枯的能力较好，降解率均在80%左右，其中BCK-3降解效果优于其他2株菌。

3 结论与讨论

本研究中，从滨州沾化长期使用百草枯的土壤中富集、筛选分离出3株具有百草枯降解能力的菌株，并进一步研究了这3株优势菌的生理生化特征及最佳生长条件。通过形态学观察和生理生化指标的测定，对这3株菌种进行鉴定，初步确定：BCK-1为颤螺菌属，BCK-2为梭菌属，BCK-3为芽孢盐杆菌属。这3株菌株在37℃培养3d后，发现其在实验室条件下对百草枯的降解率分别为79.35%、80.26%、86.22%。可能由于这3株优势降解菌分离自黄河三角洲腹地的盐碱地，具有较强的耐盐能力[15]。因此，这3株优势菌种可应用于受百草枯污染的菌源土壤的生物恢复。

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[12]李颖，贾丽娜，张鹏.高效生物修复菌株的筛选及其降解能力的研究[J].化工环保，2004，24（S）：15-17.

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[15]Karen MK，Sherry LH，Douglas CN.Novel，attached，sulfur-oxidizing bacteria at shallow hydrothermal ventspossess vacuoles not involved in respiratory nitrate accu-mulation[J].Appl Environ Microbiol，2004，70：7 487-7 496.

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