转AmGS抗寒基因红叶石楠对土壤微生物的影响

白朋等

摘 要：采用稀释平板法对转AmGS抗寒基因红叶石楠的土壤微生物的数量与种类进行测定，并对细菌、真菌菌株培养性状进行了分析，结果表明：转AmGS基因红叶石楠根际土壤与对照组相比，细菌和真菌的种类和数量没有发生明显变化；细菌菌群中以杆菌属为主，真菌菌群中以木霉属为主，转基因红叶石楠对土壤微生物的多样性无明显影响。

关键词：AmGS抗寒基因；红叶石楠；土壤微生物

中图分类号 S79 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）08-28-03

Abstract：An experiment was conducted to determine to dilution plate method for transfer AmGS cold-tolerant gene Photinia×fraseri microbial species and quantity of rhizosphere soil，and bacterial，fungal strains were cultured traits were analyzed，the results showed that：transfer AmGS gene Photinia×fraseri compared with the control group，no significant change bacterial species，fungi species and number did not change；The genera of Trichoderma were dominant in fungi communities and Bacillus in bacterial communities. The transgenic Photinia×fraseri had no evident effect on soil microbial diversity.

Key words：AmGS cold-tolerant gene；Photinia×fraseri；soil microbes

由于受地域及气候影响，我国北方广大地区栽植的树种主要是落叶树种，常绿树种多为针叶树，极少的常绿阔叶树只能在山东省南部地区种植，北方大中城市（如北京、天津等）基本上没有常绿阔叶乔木树种，达不到四季常青的绿化效果，极大限制了城市园林绿化及苗木产业的发展。而植物转基因技术的发展为解决观赏园艺植物耐寒问题提供了有效的新途径，利用抗寒基因转化园林植物优良品种，培育转基因抗寒良种，将对丰富园林常绿阔叶树，达到“三季有花、四季常绿”的效果，以及发展绿化苗木与花卉产业具有十分重要的意义。

红叶石楠（Photinia×fraseri）是石楠属的杂交种，为常绿小乔木或多枝丛生灌木，单叶轮生，叶披针形至长披针形，新梢及嫩叶鲜红色，老叶革质，叶表深绿具光泽，叶背绿色，光滑无毛。转AmGS基因红叶石楠是泰安市泰山林业科学研究院与中科院遗传与发育研究所共同通过克隆木本植物沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶（AmGS）基因，利用根癌农杆菌介导遗传进行转化，将AmGS基因导入红叶石楠中，经多年试验，该品系表现出较强的抗寒特性。为了能够更快、更安全地进行示范推广，笔者开展了转AmGS抗寒基因红叶石楠对土壤微生物多样性的影响研究。

土壤微生物的多样性是衡量生态系统稳定性的重要指标。微生物普遍存在于土壤、空气、水中，对环境条件的变化反应非常敏感，它能够较早地预测土壤养分及环境质量的变化，是测定环境变化重要的生物指标之一。研究表明，转基因植物的外源基因及其基因表达产物可通过植株的根系分泌物或残茬进入土壤生态系统，或者通过基因水平转移使得外源基因整合进土壤微生物的基因组中，可能使土壤微生物的遗传和功能特性发生某种程度的改变，进而影响土壤微生物的多样性。土壤微生物在生态系统中有其它生物无法代替的作用，随着各种转基因植物的不断选育种植，这种变化对土壤微生物存在潜在危险，可能对生态系统造成影响。本文采用平板培养法研究了转AmGS基因红叶石楠对根际土壤微生物数量的影响，并研究了不同植株根际土壤细菌和真菌的培养性状[1-2]。

1 材料与方法

1.1 供试材料 转AmGS抗寒基因红叶石楠，对照为“红罗宾”红叶石楠，均由泰山林业科学研究院提供。

1.2 试验地点 泰山林科院肥城三环基地，面积约333.5m2。

1.3 土壤采样 采用3点取样法，在林地中选取转基因植株和对照植株各3株，采集供试植株周边根系土壤，采集时去除表层枯叶，用取样器取0～10cm的土样，转入干净的保鲜袋中，采集后5℃冷藏保存，然后对土壤微生物进行分析。

1.4 土壤微生物的分离、培养和鉴定 细菌、真菌的分离、培养和鉴定均参照孙海伟[3]的方法进行。实验数据使用SPSS 16.0统计软件、Excel 2003进行分析。

2 结果与分析

2.1 土壤中的微生物数量 利用平板菌落计数法对细菌菌落数量进行计数，详见图1。由图1可知，转基因植株根际土壤中细菌菌落数量1.09±0.106×108 CFU/g，非转基因植株根际土壤中细菌菌落数量1.25±0.070 1×108 CFU/g，F=1.52，P>0.05，表明转基因植株与非转基因植株根际土壤细菌菌落数量无显著差异性。利用刮板接种法对真菌菌落的数量进行计数，详见图2。由图2可知，转基因植株根际土壤中真菌菌落数量1.37±0.293×104 CFU/g，非转基因植株根际土壤中细菌菌落数量1.61±0.173×104 CFU/g，F=0.465，P>0.05，表明转基因植株与非转基因植株根际土壤真菌落数量无显著差异性。

2.2 土壤微生物的培养性状

2.2.1 土壤中细菌菌株 对土壤细菌进一步分离、纯化及培养，经培养性状和形态特征鉴定后，转基因植株和非转基因植株根际土壤均分离得到8个细菌菌株，结果详见表1。由表1可知，转基因植株根际土壤细菌株系分别为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、黄单胞杆菌（Xanthomonas Campestris）、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis）、杆菌1（bacillus，未定名）、杆菌2、球菌1、球菌2、杆菌3，其中杆菌3未在非转基因根际土壤中发现，其余菌株均分离得到；非转基因植株根际土壤细菌株系分别为蜡样芽胞杆菌、黄单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、杆菌1、杆菌2、球菌1、球菌2、杆菌4，其中杆菌4未在转基因植株根际土壤中发现，其余菌株均分离得到，表明转AmGS抗寒基因红叶石楠对土壤细菌的种类无明显的影响。endprint

2.2.2 土壤中真菌菌株 通过对土壤中真菌的分离纯化，根据培养形态及形态特征进行鉴定，结果详见表2。由表2可知，转基因根际土壤中真菌菌株为木霉属（Triichoderma）、青霉属（Penicillium），2种菌株均在非转基因植株根际土壤中分离得到；非转基因根际土壤中真菌菌株为曲霉属（Aspergillus）、木霉属、青霉属，其中曲霉属未在转基因植株的根际土壤中分离得到，表明转AmGS抗寒基因红叶石楠对土壤真菌的种类无明显的影响。

3 结论与讨论

本试验研究了转基因红叶石楠对土壤微生物中细菌和真菌数量、种类的影响，综上所述，转基因红叶石楠对土壤微生物中的细菌和真菌的多样性无明显的影响。

土壤微生物在生态环境中有着不可替代的作用，由于传统生物技术和实验条件的限制，人工可分离培养的土壤微生物只占到总量的1%～5%，大量的土壤微生物不能分离培养。近些年来，分子生物学技术发展迅速，已经在土壤微生物的分析中应用，克服了传统生物技术的限制，更能全面有效地分析土壤微生物多样性的特征。本研究中利用刮板接种法对真菌数量进行计数和利用平板菌落计数法对细菌进行计数，在实验中存在诸多的局限和不足，不能全面的揭示转基因植物对土壤微生物多样性的影响，所以在土壤微生物群落多样性的研究中，应结合现代生物技术，但也不能忽视传统微生物培养方法的作用。

本研究只是初步探讨了菌群的数量和菌落的外观性状，仅对细菌和真菌的菌群进行了部分研究，对于转基因植物对土壤微生物的影响还需要利用现代生物学技术进一步深入的研究。下一步应当对不同季节的土壤微生物群落变化及相同季节的土壤微生物群落稳定性的差异，分析微生物生理生化特征，通过在分子水平上的研究，结合特定DNA序列分析、限制性片段长度多态性技术等研究微生物群落的多样性，绕过微生物菌种分离培养技术难关，直接在基因水平上研究。对于微生物多样性，理应使用更多的技术从更多的方面来研究，从而更广泛的、更完全的揭示土壤中微生物的种群结构及其动态变化的特征，有效地揭示微生物多样性对生态环境的影响[4-11]。

参考文献

[1]周艳红，丁衬衬，史建荣.转基因作物对土壤微生物多样性影响研究技术的进展[J].江苏农业科学，2010，04：362-365.

[2]高尚坤，刘静，黄艳艳，等.转TCS基因泡桐对土壤微生物的影响[J].东北林业大学学报，2012，04：41-45.

[3]孙海伟.沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶（AmGS）基因转化类茶植物红叶石楠的研究[D].山东农业大学，2012.

[4]张昌朋.除草剂咪唑乙烟酸对土壤微生物多样性影响及环境行为研究[D].中国农业科学院，2010.

[5]郭旺.转基因大豆玉米小麦信息平台建设及转基因大豆对土壤微生物的影响研究[D].南京农业大学，2011.

[6]曹媛媛.不同环境下水稻土硫和重金属形态转化及微生物生态研究[D].浙江大学，2008.

[7]张铃.转SrMV-P_1基因甘蔗的环境安全性评价[D].福建农林大学，2011.

[8]周海舟.应用PCR-DGGE技术研究锰污染农田土壤微生物群落遗传多样性[D].湖南大学，2008.

[9]陈伟.苹果园土壤微生物类群与栽培环境关系的研究[D].山东农业大学，2007.

[10]姚晓华.土壤微生物群落多样性研究方法及进展[J].广西农业生物科学，2008，S1：84-88.

[11]姚晓华.新杀虫剂啶虫脒对旱地土壤微生物生态影响及其降解研究[D].浙江大学，2005. （责编：张宏民）endprint

2.2.2 土壤中真菌菌株 通过对土壤中真菌的分离纯化，根据培养形态及形态特征进行鉴定，结果详见表2。由表2可知，转基因根际土壤中真菌菌株为木霉属（Triichoderma）、青霉属（Penicillium），2种菌株均在非转基因植株根际土壤中分离得到；非转基因根际土壤中真菌菌株为曲霉属（Aspergillus）、木霉属、青霉属，其中曲霉属未在转基因植株的根际土壤中分离得到，表明转AmGS抗寒基因红叶石楠对土壤真菌的种类无明显的影响。

3 结论与讨论

本试验研究了转基因红叶石楠对土壤微生物中细菌和真菌数量、种类的影响，综上所述，转基因红叶石楠对土壤微生物中的细菌和真菌的多样性无明显的影响。

土壤微生物在生态环境中有着不可替代的作用，由于传统生物技术和实验条件的限制，人工可分离培养的土壤微生物只占到总量的1%～5%，大量的土壤微生物不能分离培养。近些年来，分子生物学技术发展迅速，已经在土壤微生物的分析中应用，克服了传统生物技术的限制，更能全面有效地分析土壤微生物多样性的特征。本研究中利用刮板接种法对真菌数量进行计数和利用平板菌落计数法对细菌进行计数，在实验中存在诸多的局限和不足，不能全面的揭示转基因植物对土壤微生物多样性的影响，所以在土壤微生物群落多样性的研究中，应结合现代生物技术，但也不能忽视传统微生物培养方法的作用。

本研究只是初步探讨了菌群的数量和菌落的外观性状，仅对细菌和真菌的菌群进行了部分研究，对于转基因植物对土壤微生物的影响还需要利用现代生物学技术进一步深入的研究。下一步应当对不同季节的土壤微生物群落变化及相同季节的土壤微生物群落稳定性的差异，分析微生物生理生化特征，通过在分子水平上的研究，结合特定DNA序列分析、限制性片段长度多态性技术等研究微生物群落的多样性，绕过微生物菌种分离培养技术难关，直接在基因水平上研究。对于微生物多样性，理应使用更多的技术从更多的方面来研究，从而更广泛的、更完全的揭示土壤中微生物的种群结构及其动态变化的特征，有效地揭示微生物多样性对生态环境的影响[4-11]。

参考文献

[1]周艳红，丁衬衬，史建荣.转基因作物对土壤微生物多样性影响研究技术的进展[J].江苏农业科学，2010，04：362-365.

[2]高尚坤，刘静，黄艳艳，等.转TCS基因泡桐对土壤微生物的影响[J].东北林业大学学报，2012，04：41-45.

[3]孙海伟.沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶（AmGS）基因转化类茶植物红叶石楠的研究[D].山东农业大学，2012.

[4]张昌朋.除草剂咪唑乙烟酸对土壤微生物多样性影响及环境行为研究[D].中国农业科学院，2010.

[5]郭旺.转基因大豆玉米小麦信息平台建设及转基因大豆对土壤微生物的影响研究[D].南京农业大学，2011.

[6]曹媛媛.不同环境下水稻土硫和重金属形态转化及微生物生态研究[D].浙江大学，2008.

[7]张铃.转SrMV-P_1基因甘蔗的环境安全性评价[D].福建农林大学，2011.

[8]周海舟.应用PCR-DGGE技术研究锰污染农田土壤微生物群落遗传多样性[D].湖南大学，2008.

[9]陈伟.苹果园土壤微生物类群与栽培环境关系的研究[D].山东农业大学，2007.

[10]姚晓华.土壤微生物群落多样性研究方法及进展[J].广西农业生物科学，2008，S1：84-88.

[11]姚晓华.新杀虫剂啶虫脒对旱地土壤微生物生态影响及其降解研究[D].浙江大学，2005. （责编：张宏民）endprint

2.2.2 土壤中真菌菌株 通过对土壤中真菌的分离纯化，根据培养形态及形态特征进行鉴定，结果详见表2。由表2可知，转基因根际土壤中真菌菌株为木霉属（Triichoderma）、青霉属（Penicillium），2种菌株均在非转基因植株根际土壤中分离得到；非转基因根际土壤中真菌菌株为曲霉属（Aspergillus）、木霉属、青霉属，其中曲霉属未在转基因植株的根际土壤中分离得到，表明转AmGS抗寒基因红叶石楠对土壤真菌的种类无明显的影响。

3 结论与讨论

本试验研究了转基因红叶石楠对土壤微生物中细菌和真菌数量、种类的影响，综上所述，转基因红叶石楠对土壤微生物中的细菌和真菌的多样性无明显的影响。

土壤微生物在生态环境中有着不可替代的作用，由于传统生物技术和实验条件的限制，人工可分离培养的土壤微生物只占到总量的1%～5%，大量的土壤微生物不能分离培养。近些年来，分子生物学技术发展迅速，已经在土壤微生物的分析中应用，克服了传统生物技术的限制，更能全面有效地分析土壤微生物多样性的特征。本研究中利用刮板接种法对真菌数量进行计数和利用平板菌落计数法对细菌进行计数，在实验中存在诸多的局限和不足，不能全面的揭示转基因植物对土壤微生物多样性的影响，所以在土壤微生物群落多样性的研究中，应结合现代生物技术，但也不能忽视传统微生物培养方法的作用。

本研究只是初步探讨了菌群的数量和菌落的外观性状，仅对细菌和真菌的菌群进行了部分研究，对于转基因植物对土壤微生物的影响还需要利用现代生物学技术进一步深入的研究。下一步应当对不同季节的土壤微生物群落变化及相同季节的土壤微生物群落稳定性的差异，分析微生物生理生化特征，通过在分子水平上的研究，结合特定DNA序列分析、限制性片段长度多态性技术等研究微生物群落的多样性，绕过微生物菌种分离培养技术难关，直接在基因水平上研究。对于微生物多样性，理应使用更多的技术从更多的方面来研究，从而更广泛的、更完全的揭示土壤中微生物的种群结构及其动态变化的特征，有效地揭示微生物多样性对生态环境的影响[4-11]。

参考文献

[1]周艳红，丁衬衬，史建荣.转基因作物对土壤微生物多样性影响研究技术的进展[J].江苏农业科学，2010，04：362-365.

[2]高尚坤，刘静，黄艳艳，等.转TCS基因泡桐对土壤微生物的影响[J].东北林业大学学报，2012，04：41-45.

[3]孙海伟.沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶（AmGS）基因转化类茶植物红叶石楠的研究[D].山东农业大学，2012.

[4]张昌朋.除草剂咪唑乙烟酸对土壤微生物多样性影响及环境行为研究[D].中国农业科学院，2010.

[5]郭旺.转基因大豆玉米小麦信息平台建设及转基因大豆对土壤微生物的影响研究[D].南京农业大学，2011.

[6]曹媛媛.不同环境下水稻土硫和重金属形态转化及微生物生态研究[D].浙江大学，2008.

[7]张铃.转SrMV-P_1基因甘蔗的环境安全性评价[D].福建农林大学，2011.

[8]周海舟.应用PCR-DGGE技术研究锰污染农田土壤微生物群落遗传多样性[D].湖南大学，2008.

[9]陈伟.苹果园土壤微生物类群与栽培环境关系的研究[D].山东农业大学，2007.

[10]姚晓华.土壤微生物群落多样性研究方法及进展[J].广西农业生物科学，2008，S1：84-88.

[11]姚晓华.新杀虫剂啶虫脒对旱地土壤微生物生态影响及其降解研究[D].浙江大学，2005. （责编：张宏民）endprint