精索静脉曲张引起大鼠生殖功能改变及睾丸HSP90α表达变化

韩俊岭　孔晓君　李建远

【摘要】 目的 探讨精索静脉曲张后大鼠生殖功能的变化和睾丸中热休克蛋白90α（HSP90α）的表达变化及规律。方法 将32只SD大鼠随机分成4组：对照组和3个精索静脉曲张组（造模成功后第1、3、6周）。分别测定各组大鼠的相应脏器指数，检测精子相关指标、睾丸中HSP90α的表达。结果 精索静脉曲张后，大鼠附睾指数在1、3周时显著低于对照组；精子活力1、3、6周组显著低于对照组，精子畸形率在1周3周时间点明显高于对照组，而1、3周时间点精子存活率显著低于对照组，其他试验组与对照组相比无显著差异；1、3、6周组睾丸中HSP90α的表达均显著高于对照组（P<0.05）。结论 精索静脉曲张可引起大鼠生殖系统损伤以及睾丸中HSP90α的高表达，提示HSP90α可能保护机体在静脉曲张状态下受到的损伤。

【关键词】 精索静脉曲张；热休克蛋白90α；生殖；大鼠

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.05.001 文章编号：1004-7484（2014）-05-2405-02

Varicocele causes an Alteration of Reproductive function and Induction of HSP90α Expression in testis of Rat

【Abstract】 Objective To investigate the changes of reproductive function and Hsp90α gene expression in reproductive system of rat with varicocele.Methods Healthy 32 SD rats were randomly divided into 4 groups：control group and 3 varicocele group（1，3 and 6w after varicocele）.Organ index and HSP90α gene expression in testicle were determined.Result At 1 and3w the epididymis index was significantly lower than it in the control；sperm motility rate is significantly lower than the control group at 1，3w and 6w（P<0.05），Sperm deformity and morality rate were significantly higher than the control group at 1 and 3w（P<0.05）.Gene expression of HSP90α in testicle was significantly higher than those in the control group at1，3 and 6w group（P<0.05）.Conclusion Varicocele resulted in the damage of reproductive system，and the increased expression of HSP90α gene in testicle.The increased expression of HSP90α gene may protect cells from varicocele damage.

【Key words】 Varicocele；Heat shock protein90α；Reproduction；Rat

男性不育癥已经成为一个全球性问题，其中精索静脉曲张是引起男性不育的最常见原因之一，研究发现成年男性中约有2%-22%的人发病，在指标异常的患者中，精索静脉曲张的患病率为25%-40%[1]。现已证明曲张可引起临床上睾丸萎缩、精子产生不足以及生育力下降，但精索静脉曲张引起生殖功能异常的机制尚未完全阐明[2]。HSP90α主要存在于大脑和睾丸中[3]。因此，了解精索静脉曲张后睾丸中HSP90α表达的改变具有重要意义。本实验以HSP90α和生殖功能的关系为切入点，探讨精索静脉曲张发生的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 实验所用青春期雄性SD大鼠32只，6周龄，体重170-220g，SPF级。由滨州医学院动物实验中心提供。全自动精子分析仪采用美国汉密尔顿（IVOS-CASA）系统。实验中所用化学试剂均为分析纯。

1.2 实验方法 将32只SD大鼠随机分为正常对照组和精索静脉曲张组。各组造模成功后再按1、3、6周随机分成3个亚组，每组8只大鼠。模型制备参考刘建军等[4]的方法，行腹部正中切口，在精索静脉内侧、下腔静脉外侧及左肾静脉下钝性分离出一个开口，结扎左肾静脉，使左肾静脉直径缩小约50%。对照组大鼠暴露左肾静脉过程相同，但不结扎。各亚组大鼠分别于精索静脉曲张后1、3、6周予断颈处死，取左侧睾丸、附睾及前列腺称重，用于计算脏器系数，之后用多聚甲醛溶液固定，制作石蜡切片，用于组织学研究。右侧睾丸取一部分组织提取RNA，用作PCR检测。右侧附睾用于制备精子悬液，检测精子相关指标。

1.3 检测项目

1.3.1 睾丸、附睾及前列腺质量指数 质量系数公式为：质量指数=器官质量（mg）/大鼠质量（g）。

1.3.2 精子活力、活率、畸形率检测 取出附睾，收集精液并置于37℃环境中。用全自动精子分析仪检测精子的相关指标。累计检测400个精子，计算精子的总活力。用相差显微镜计数400个精子，计算存活率。用高倍镜顺序计数400个精子并检查精子形态，计数结构完整精子数。

1.3.3 睾丸中HSP90α基因的RT-PCR检测 提取睾丸中的RNA，逆转录后对HSP90α基因和β-actin进行PCR扩增，采用凝胶成像系统拍照并进行光密度分析。

1.4 统计学方法 数据中计量资料采用Mean±s表示，运用统计软件SPSS18.0进行处理分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精索静脉曲张对大鼠脏器指数的影响 各组大鼠的睾丸、附睾及前列腺质量指数结果，见表1。结果显示1、3周组的附睾指数与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 精索静脉曲张后大鼠脏器指数的变化（Mean±SD，n=8）

2.3 精索静脉曲张对大鼠睾丸中HSP90α表达的影响 在正常情况下，睾丸组织中HSP90α的表达量较低。精索静脉曲张造模后，睾丸中HSP90α的表达水平开始升高，在3周达到高峰，见图1。在1、3、6周组均显著高于对照组（P<0.05）。

3 讨论

精索静脉曲张能够影响男性生育功能，该疾病日益引起人们的关注。然而精索静脉曲张的机制尚不完全清楚，其可以通过多种方式影响到睾丸、附睾的结构和功能。热休克蛋白普遍存在于原核和真核生物体内，高温、寒冷、低氧、创伤等均可以引起热休克蛋白的高表达，其中HSP90可通过维持信号分子蛋白的稳定性，参与细胞内多条信号转导通路的生理过程，从而协助机体对抗不良环境[5]。

本实验结果显示：精索静脉曲张后大鼠睾丸及前列腺指数均有所下降，但与对照组相比差异无统计学意义，然而附睾指数则显著降低。该结果可能与他们的组织结构、生理功能不同相关，具体原因和机制需要进一步研究。此外精索静脉曲张导致大鼠精子的活力明显下降、畸形率显著升高，其原因和机制有待进一步分析和研究。

HSP90α是胞内蛋白，与多种损伤密切相关，由于其作用底物与多种细胞信号转导通路密切相关，且可以作为分子伴侣发挥作用[6]，其生理作用越发引起人们的关注，但在生殖系统中的研究较少，本实验研究了精索静脉曲张前、后HSP90α在睾丸中的表达情况，PCR结果显示精索静脉曲张前HSP90α在睾丸中的表达相对较弱，精索静脉曲张后表达量明显增强，且有时间性。提示在精索静脉曲张过程中，在不同的时间点HSP90α发挥着对生殖系统的保护作用，具体机制需要做进一步的深入研究。

综上所述，精索静脉曲张对雄性SD大鼠的生殖系统造成了损伤。PCR结果表明HSP90α可能参与睾丸中精子的发生与附睾内精子的成熟，对于HSP90α在精索静脉曲张时所发挥的作用，人们的认识还非常有限。需要做进一步的研究，以便深入地了解精索静脉曲张和男性不育。

参考文献

[1] Zhang H J，Xu L，Drake V J，et al.Heat-induced liver injury in old rats is associated with exaggerated oxidative stress and altered transcription factor.Activation[J].FASEB Journal，2003，17：2293-2295.

[2] Vos MJ，Hageman J，Carra S，et al.Structural and functional diversities between members of the human HSPB，HSPH，HSPA，and DNAJ chaperone families[J].Biochemistry，2008，47（27）：7001-11.

[3] 戎成婷，韓俊岭，杜振宁.HSP90β在小鼠生殖系统中的表达及调控[J].南方医科大学学报，2013，33（4）：491-495.

[4] 刘建军，杨宇如，董强.实验性精索静脉曲张模型的建立及其对睾丸的影响[J].华西医学，2006，21（3）：538-539.

[5] Jianxiong Chen，Barbara Meyrick et al.Hypoxia increases Hsp90 binding to eNOS viaPI3K-Akt in porcine coronary artery endothelium.Laboratory Investigation，2004，84（2）：182-190.

[6] Jascur T，Brickner H，Salles-Passador I，et al.Regulation of p21（WAF1/CIP1）stability by WISp39，an Hsp90 binding TPR protein[J].Mol Cell，2005，17（2）：237-249.