维拉帕米对缺氧复氧心肌细胞自噬的影响

侯贞秀，李 哲

心肌细胞在缺氧／复氧过程中有不同程度的自噬参与。在缺氧／复氧的不同阶段，自噬所起的作用不同。在缺氧期，自噬主要起保护作用，而复氧期则主要起损伤作用［1，2］。如何通过抑制自噬降低缺氧／复氧心肌细胞的死亡，提高其存活率，是目前研究的热点［3］。本文采用体外培养心肌细胞，建立缺氧／复氧模型，模拟在体缺血／再灌注损伤过程，从基因水平上观察心肌细胞在缺氧／复氧过程中给予维拉帕米后对心肌细胞的保护作用。为缺血／再灌注心肌细胞的进一步治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 实验动物 购自博研（上海）生物科技有限公司。

1.2 主要药品与试剂 盐酸维拉帕米注射液购自上海禾丰制药有限公司；胎牛血清购自四季青，浙江天杭生物科技有限公司；DMEM 购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司；Trizonal购自北京康为世纪生物科技有限公司；PCR 反转录试剂盒购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；PCR 引物由生物工程（上海）股份有限公司设计；3－MA 购自selleckchem 公司；连二亚硫酸钠购自sigma公司；DMSO 购自sigma公司；MTT（四氮唑蓝）Amresco公司；SYBR 染料购自北京全式金生物技术有限公司。主要仪器，LS－B50L型立式压力蒸气灭菌器：江阴滨江医疗设备厂L－550型台式低速大容量离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；倒置显微镜：上海电子仪器厂二氧化碳培养箱：Heraeus公司；德国AB104－N 型电子天平：上海电子仪器厂；SW－CJ－2F超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司Q－PCR仪：美国BIO－RAD公司。

1.3 乳鼠心肌细胞的培养 H9c2心肌细胞复苏后置于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养，倒置相差显微镜下观察心肌细胞的形态，隔天用D－Hanks液为心肌细胞换液，生长至约80%时，传代培养，采用第3代～4代心肌细胞进行实验。

1.4 建立缺氧／复氧模型及实验分组 缺氧／复氧模型的建立［4］：采用连二亚硫酸钠化学法，用D－Hanks液将其配成浓度为18g／L，分装，置－20℃冰箱中保存，临用时稀释成终浓度为5mmol／L，加入DMEM 培养液中，制成缺氧液。用缺氧液换用正常培养基培养1h，模拟缺氧过程，再换用正常DMEM 培养液（复氧液）培养4h，模拟复氧过程。将培养第3代～4代传代心肌细胞随机分为5组，空白对照组：正常DMEM 培养基＋胎牛血清培养；缺氧／复氧组［4］：将DMEM 培养液换成缺氧液培养1h，再换用复氧液培养4h，即为缺氧／复氧处理。缺氧／复氧＋3－MA 组：在缺氧液中加入终浓度为5mmol／L［5］的3－MA 培养1h［6］，再换用终浓度为5mmol／L的3－MA 复氧液培养4h。缺氧／复氧＋维拉帕米组：在缺氧液中加入终浓度为1mg／L 的维拉帕米培养1h，再换用终浓度为1mg／L的维拉帕米复氧液培养4h。缺氧／复氧＋3－MA＋维拉帕米组：在缺氧液中加入终浓度为1mg／L的维拉帕米与终浓度为5mmol／L 的3－MA 共同培养1h，再换用含终浓度为1mg／L 的维拉帕米与终浓度为5 mmol／L的3－MA 复氧液共同培养4h。

1.5 MTT 法检测心肌细胞的存活率［7］采用对数生长期的心肌细胞（第3～4代心肌细胞），按上述分组方法进行分组，然后0.25%胰酶消化后用DMEM 培养液调成浓度为约5×104／mL的单细胞悬液，分配至96板孔中，每孔约100μL，每组设10个复孔，置于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养24h后，吸弃上清液，加入MTT 工作液（5g／L），每孔约10μL；37℃，5%二氧化碳培养箱中继续培养4h，吸弃培养基，加入每孔200μLDMSO 终止反应，置于摇床上轻微震荡10min。在酶标仪570nm 波长下测定吸光度A 值。细胞存活率（survival rate SR）：SR／%＝（A 实验组／A 对照组）1）100%。

1.6 RT－PCR法检测Beclin－1、LC－3mRNA及Bcl－2mRNA的表达 采用Trizonal试剂法按照Trizonal试剂说明提取总RNA。MJ PCR 仪进行PCR 反转录，反转录液：总RNA2μL，RNAase Free dH2O 6μL，总量10μL，共配5 份；反转录程序：37℃15 min 85℃5s4℃1h，cDNA 置于1 mL EP 管中。RT－PCR 反应液体系：Template 2μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，21）mix 10μL，ddH2O 7.2μL，总体积20μL，共配体系20份。总体系配好后，用枪吸打均匀，54μL 每份中加入6μL 模板，分装至8连管中，每组设3个复孔。实验采用β－actin作为内参，置于qPCR 仪中，程序：94℃30s，94℃5s，60℃30s，95℃1h，55℃1h，55℃20s，共扩增45个循环。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件处理，定量资料采用均数±标准差描述，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD－t检验。检验水准α＝0.05。

2 结 果

2.1 对心肌细胞存活率的影响 与正常对照组相比，缺氧／复氧组心肌细胞存活率降低（P＜0.05），与缺氧／复氧组相比，维拉帕米组，3－MA 组，维拉帕米组＋3－MA 组心肌细胞存活率均增高（P＜0.05）。详见表1。

表1 5组心肌细胞存活率的比较

表1 5组心肌细胞存活率的比较

与空白对照比较，1）P＜0.05；与H／R 组比较，2）P＜0.05；与维拉帕米组比较，3）P＜0.05

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2.2 Beclin－1、LC－3 及Bcl－2mRNA 的 表 达 RT－PCR 结 果 显示：与 空 白 对 照 组 相 比，缺 氧／复 氧 组Beclin－1、LC－3 mRNA表达量均上调（P＜0.0 5），Bcl－2mRNA的表达下降（P＜0.05）；3－MA 组，维拉帕米组及3－MA 组＋维拉帕米组Beclin－1、LC－3mRNA 表 达 量 均 下 降（P ＜0.05），3－MA 组，维 拉 帕米组及3－MA组＋维拉帕米组Bcl－2mRNA的表达增加（P＜0.05）。与缺氧／复氧组相比，3－MA 组，维拉帕 米组，3－MA组＋维拉帕米组Beclin－1、LC－3mRNA表达量均下降（P＜0.05），维拉帕米组及3－MA 组＋维拉帕米组Bcl－2mRNA表达均上调（P＜0.05），3－MA 组Bcl－2mRNA 无明显变化。详见表2。

表2 3种基因的值比较

表2 3种基因的值比较

与空白对照比较，1）P＜0.05；与缺氧复氧组比较，2）P＜0.05；与3－MA＋维拉帕米组比较，3）P＜0.05

组别Beclin－1 Bcl－2 LC－3空白对照组 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00缺氧复氧组 3.48±0.021） 0.74±0.021） 3.14±0.071）3－MA 抑制剂组 1.87±0.021）2）3）0.77±0.031）3） 2.05±0.041）2）3）维拉帕米组 0.59±0.021）2）3）1.79±0.031）2）3）1.71±0.021）2）3）3－MA＋维拉帕米组 0.69±0.021）2） 2.37±0.031）2）1.55±0.021）2）F 值 11 999.16 2 345.03 1 411.94 P 0.001 0.001 0.001

3 讨 论

近年来，与传统死亡方式凋亡相比，人们更加关注Ⅱ型程序性死亡方式自噬［8］。自噬的发生是首先形成自噬体，然后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最后降解其所包裹的内容物。其中，自噬发生的重要环节在于自噬体的形成［9］。自噬体的形成需要多种自噬相关基因（Atg）的参与［9］，如：Beclin－1（酵母Atg6的同源），Atg5，Atg16，Atg，12，Atg8（LC－3的同源）等。雷帕霉素通路（mTOR 通路）及Bcl－2／Beclin－1通路是两条熟知的自噬信号调节通路。在自噬体调节过程中，Atg12－Atg5－Atg16可与LC－3及Atg9一起被转运至自噬泡，参与自噬泡的扩展。同时，磷脂酰激酶3（PI3K）可与Beclin1结合，形成复合体负责调控自噬体膜的凝集，并包裹蛋白质，蛋白质复合体及细胞器。Bcl－2／Beclin－1 通 路 中，Bcl－2 可 通 过 结 合 并 抑 制PI3K复合体的重要组成成分Beclin－1来抑制这一过程。而3－MA 作为一种非特异性的PI3K 抑制剂，参与抑制自噬体形成的过程［10］。

在细胞自噬的诱导和调节过程中，许多刺激因子均可以诱导细胞产生自噬，如营养缺乏、缺血、缺氧、细胞内钙超载、氧化应激及内质网应激等。缺氧／复氧损伤可以导致心肌细胞钙超载，而钙离子拮抗剂维拉帕米可通过拮抗钙超载从而保护心肌细胞［11］。

自噬在缺氧／复氧过程中的调节起“双刃剑”作用。在缺氧过程中，通过Beclin－1、Atg5，LC－3等的上调激活自噬，起保护作用，而在再灌注过程中，自噬测过度表达则影响细胞的存活率。

本实验成功建立体外缺氧／复氧模型，模拟在体缺血再灌注损伤过程。通过预实验发现不同浓度维拉帕米对缺氧／复氧心肌细胞存活率影响不同，表明浓度为1mg／L 的维拉帕米较其他浓度对缺氧／复氧心肌细胞存活率高。提示适宜浓度维拉帕米预处理可发挥对缺氧／复氧损伤心肌细胞的保护作用。而自噬抑制剂3－MA 在 复 氧 时 使 用，使Beclin－1、LC－3 mRNA 表 达量下降，同时，提高了细胞的存活率，而维拉帕米使Bcl－2 mRNA 表达量增加，Beclin－1、LC－3 mRNA 表达量下降，自噬抑制剂3－MA 合用维拉帕米可使Bcl－2 mRNA 表达量增加，与单用维拉帕米差异无统计学意义，Beclin－1、LC－3 mRNA 表达量下降，差异有统计学意义。表明维拉帕米可能通过Bcl－2／Beclin－1通路抑制LC－3的表达，提高缺氧／复氧心肌细胞的存活率，从而保护心肌细胞。维拉帕米处理对缺氧／复氧心肌细胞有保护作用，推测Bcl－2／Beclin－1 通路在其保护机制中发挥重要作用。其具体机制有待进一步研究。

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