帕米膦酸二钠对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

徐妍 张慧 刘江峰 朱玉婷 田爱峰 范长斌 黄江勇 吴瑛 于淼 林凤燕 赵爽 陈晶砺 毕晓云

双磷酸盐是一种人工合成药物，广泛用于骨吸收性疾病，尤其适用于60岁以上老年患者[1]。这类药物也用于骨肿瘤及肿瘤骨转移的辅助治疗。双磷酸盐可调节骨代谢，主要作用在于吸附于破骨细胞表面，抑制破骨细胞活性，引起破骨细胞凋亡，从而导致骨吸收减少[2]。近年来的研究表明，双磷酸盐也可作用于其他类型细胞，包括成骨细胞、成纤维细胞和内皮细胞，抑制细胞增殖，减低细胞活性，抑制细胞分泌生长因子和Ⅰ型胶原[3-6]。在吸附双磷酸盐的骨组织表面可以形成新骨，但药物与新生骨中的基质结合后不再具有药理活性，必须持续服用这类药物，以抑制新形成骨表面的破骨细胞。然而，骨坏死是长期服用双磷酸盐严重的副作用，发生机制尚不清楚，但推测可能与其对成骨细胞的毒性有关。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是一种成体干细胞，具有分化为成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞等的能力。MSC广泛存在于骨髓及骨实质组织中。双磷酸盐的毒性反应是否与MSC有关，至今尚未见报道。我们以帕米膦酸二钠为研究对象，观察药物处理后的人骨髓MSC在表面分子表达、增殖状态及成骨分化能力等的变化，以探索双磷酸盐导致骨组织损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人骨髓MSC为本研究室保存，取第1～3代细胞用于实验。帕米膦酸二钠注射液(2 mg/mL)为国内药物制剂。胎牛血清(Stem Cell公司，加拿大)。MTT、地塞米松、维生素C磷酸盐、β磷酸甘油、人胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠和磷酸对硝基苯酚(Sigma公司，美国)。小鼠抗人CD31、CD44、CD45、CD73抗体(BD公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 人骨髓MSC的复苏与培养

[7]的方法。取液氮冻存的人骨髓MSC 3份，37℃快速复苏，滴加于含10%胎牛血清的α-MEM培养基中，离心洗涤后按10 000 cells/cm2底面积接种于100 mm培养皿中。37℃、5%CO2条件下培养72 h，胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次，将细胞悬浮于α-MEM基础培养基中，调整细胞浓度为1×106cells/mL，用于后续实验。

1.2.2 MTT实验

收取人骨髓MSC，悬浮于含1%FCS的α-MEM中，调整细胞浓度为1.0×106cells/mL。体系中分别加入终浓度为0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的帕米膦酸二钠，以终浓度为10%的FCS为阳性对照。在上述体系中加入MSC悬液30 μL/mL。将细胞悬液转移至96孔板，每孔100 μL。将细胞置于37℃、5%CO2条件下培养72 h，加入MTT溶液。酶联免疫仪上测定每孔光密度值，测定波长为490 nm。以上实验重复3次，分别采用3个骨髓标本来源细胞。

1.2.3 流式细胞学技术

MSC培养体系中加入1.0 μg/mL的帕米膦酸二钠，培养1周后收集细胞，PBS洗涤2次。加入小鼠抗人CD31、CD44、CD73、CD45单克隆抗体。室温避光反应30 min后，PBS洗涤2次。FACSCalibur(美国BD公司)收集至少10 000个数据点，WINMDI2.9软件分析结果。

1.2.4 成骨诱导分化

将培养的人骨髓MSC，悬浮于含5%FCS的DMEM中，按3.0×103个/孔的密度，接种到24孔板中。分为4组，分别加入含5%FCS的DMEM(阴性对照组)、0.5 μg/mL帕米膦酸二钠、标准诱导剂组合及诱导剂组合+0.5 μg/mL帕米膦酸二钠。诱导剂组合由地塞米松(100 nM)、β-磷酸甘油(10 mM)和维生素C磷酸盐(50 μM)组成。每隔3～4天换液1次。第14天时收集细胞，裂解后分别进行蛋白质浓度及碱性磷酸酶(ALP)活性测定。使用3个不同供者来源的MSC重复上述实验。

1.2.5 碱性磷酸酶活性检测

取第14天细胞，PBS洗涤后冻融裂解。1 500 r/min离心10 min，取上清，Bradford法测定蛋白浓度，结果以OD600表示。配制碱性磷酸酶工作液，包括5 mM磷酸对硝基苯酚水溶液、50 mM甘氨酸水溶液(pH 10.5)、1.0 mM氯化镁水溶液，按1∶1与细胞裂解液混合，37℃反应15 min。加入NaOH终止液后，酶联仪测定405 nm光密度值。将碱性磷酸酶测定的OD405值与各组对应蛋白含量的OD600比值，作为各组单位蛋白重量碱性磷酸酶活性进行比较。

1.2.6 统计学分析

MTT实验所得光密度值以均数±标准差表示，组间差异采用t检验分析，P0.05为差异显著。

2 结果

2.1 不同浓度帕米膦酸二钠对人MSC增殖的影响

在MSC培养体系中加入0.1～10 μg/mL的帕米膦酸二钠，培养72 h，MTT法测定细胞活性。结果显示，当药物浓度为0.1 μg/mL和0.5 μg/mL时，OD490与对照组无显著差别(P0.05)；当药物浓度达到1 μg/mL时，OD490显著低于对照组(P0.05)；之后OD值逐渐减低，以10 μg/mL组最为明显，显著低于对照组(P0.05)(图1)。

图1 不同浓度帕米膦酸二钠对MSC增殖的影响Fig.1The inhibitory effect of different concentrations of pamidronate disodium on the growth of human bone marrow MSCs

图2 帕米膦酸二钠处理的MSC表型分析Fig.2Phenotypic profile of human MSCs treated by parmidronate

2.2 帕米膦酸二钠对MSC表面分子特征的影响

由于1 μg/mL帕米膦酸二钠明显抑制MSC增殖，我们选择0.5 μg/mL作为长期培养时的药物浓度。将细胞培养1周后，流式细胞观察细胞表面分子表达水平的变化。结果显示，MSC仍高表达CD44和CD73，不表达CD31和CD45，提示药物作用后，细胞仍具有MSC表面分子特征(图2)。

2.3 帕米膦酸二钠对MSC体外成骨分化的影响

为观察帕米膦酸二钠是否影响MSC成骨能力，MSC体系中加入0.5 μg/mL帕米磷酸钠，培养2周后裂解细胞，磷酸对硝基苯酚显色，测定OD405以显示细胞碱性磷酸酶活性。结果显示，帕米膦酸二钠组OD405与阴性对照组相当(P0.05)，显著低于标准诱导组(P0.01)，而诱导剂加帕米膦酸二钠组OD值与标准诱导组无差异。鉴于帕米膦酸二钠可抑制MSC增殖，以细胞蛋白总量为指标(OD600)，显示细胞总数，将OD405/OD600作为单位细胞所含ALP活性，获得了近似的结果。以上结果表明，帕米膦酸二钠本身无诱导MSC分化为成骨细胞的功能，也不影响MSC的成骨分化(图3)。

图3 帕米膦酸二钠对MSC体外成骨分化的影响Fig.3Effects of parmidronate on the osteogenic differentiation of MSCs

3 讨论

双磷酸盐是一类治疗骨质疏松和肿瘤骨转移的药物，其主要作用靶点是破骨细胞。我们观察了双磷酸盐对间充质干细胞生物学特性的影响。结果表明，帕米膦酸二钠可抑制MSC体外增殖，效应呈浓度依赖性，但对诱导条件下碱性磷酸酶活性无影响。在相近浓度下，帕米膦酸二钠可抑制人骨髓基质细胞的增殖，抑制其碱性磷酸酶活性，且可促进RANKL分泌，诱导破骨细胞迁徙[8]。造成结果差异的主要原因可能与使用的药物浓度有关。本实验发现1 μg/mL帕米膦酸二钠可明显抑制MSC增殖。为排除细胞增殖抑制作用，本实验采用的药物浓度为0.5 μg/mL。但是，既往文献中所报道的药物浓度为5 μg/mL，是本实验所用浓度的10倍。此外，鉴于文献所使用的浓度条件下，帕米膦酸二钠可抑制细胞增殖，在最终检测时间点，药物处理组细胞数量应大大低于未处理组，因此，直接测定ALP活性，而不考虑细胞总数，不能显示单个细胞酶含量。本实验利用蛋白质总量作为参考，以更好地体现细胞内实际的酶活性，并发现无论细胞培养过程中，或MSC在标准成骨诱导剂作用条件下，加入帕米膦酸二钠组ALP活性与对照组比较，均无明显差异，提示至少在该浓度下，帕米膦酸二钠的确不影响MSC成骨活性。截至目前，双磷酸盐抑制细胞增殖的具体机制尚不清楚，可能与药物直接作用有关[9]。

双磷酸盐主要沉积于骨组织，静脉注射或口服后，外周循环存在时间短。骨组织中富含MSC和成骨细胞，沉积过程中这两种细胞可能受药物的直接或间接作用。研究表明，浓度大于1 μg/mL的帕米膦酸二钠可抑制成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原的合成[10]，浓度达到2 μg/mL左右，培养时间超过72 h，大量成骨细胞发生凋亡[11]。在该浓度下，帕米膦酸二钠也明显抑制骨肉瘤细胞增殖，诱导瘤细胞凋亡，提示肿瘤治疗剂量与正常细胞毒性剂量相近。

骨坏死是长期使用双磷酸盐的并发症之一。本研究结果显示，高浓度帕米膦酸二钠可抑制间充质干细胞增殖。既往研究也证实，高浓度帕米膦酸二钠可诱导成骨细胞凋亡[3-6，9－10]。另外，双磷酸盐也可抑制内皮细胞和成纤维细胞活性[3]。可见，对正常细胞的毒性作用可能是双磷酸盐导致骨坏死的原因之一。双磷酸盐沉积于骨组织后代谢缓慢，因此，控制摄入量而非减少摄入时间，可能是减少骨坏死并发症的有用措施。

总之，帕米膦酸二钠可抑制人骨髓MSC增殖，但是，在低浓度条件下，并不影响MSC的成骨分化。本结果可为预防帕米膦酸盐所导致的临床并发症提供参考。

参考文献

[1]Body JJ,Mancini I.Bisphosphonates for cancer patients:why,how and when[J]?Support Care Cancer,2002,10(5):399-407.

[2]Benhamou C.Effects of osteoporosis medications in bone quality[J].Joint Bone Spine,2007,74(1):39-47.

[3]Walter C,Klein MO,Pabst A,et al.Influence of bisphosphonates on endothelial cells,fibroblasts,and osteogenic cells[J].Clin Oral Investig,2010,14(1):35-41.

[4]Scheper MA,Badros A,Salama AR,et al.A novel bioassay model to determine clinically significant bisphosphonate levels[J].Support Care Cancer,2009,17(12):1553-1557.

[5]Simon MJK,Niehoff P,Kimming B,et al.Expression profile and synthesis of different collagen types I,II,III and V of human gingival fibroblasts,osteoblasts,and SaOs-2 cells after bisphosphonate treatment[J].Clin Oral Investig,2010,14(1):51-58.

[6]Koch FP,Yekta SS,Merkel C,et al.The impact of bisphosphonates on the osteoblast proliferation and collagen gene expression in vitro[J].Head Face Med,2010,6(1):12-17.

[7]毕晓云,黄舒,郭杰,等.锌离子促进人骨髓间充质干细胞增殖并增强其纤黏连蛋白表达的实验研究[J].组织工程与重建外科,2013,9(2):81-84.

[8]Stefanik D1,Sarin J,Lam T,et al.Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate[J].Oral Dis,2008,14(5):465-471.

[9]Kaiser T,Teufel I,Geiger K,et al.Bisphosphonates modulate vital functions of human osteoblasts and affect their interactions with breast cancer cells[J].Breast Cancer Res Treat,2013,140(1):35-48.

[10]Marolt D1,Cozin M,Vunjak-Novakovic G,et al.Effects of pamidronate on human alveolar osteoblasts in vitro[J].J Oral Maxillofac Surg,2012,70(5):1081-1092.

[11]Acil Y1,Moller B,Niehoff P,et al.The cytotoxic effects of three different bisphosphonates in vitro on human gingival fibroblasts,osteoblasts and osteogenic sarcoma cells[J].J Craniomaxillofac Surg,2012,40(8):e229-e235.