从维甲酸信号途径探讨电针促进脑梗死大鼠神经功能恢复的研究1）

陶 静，洪江从，邹愉龙，薛偕华，杨珊莉，林志诚，陈立典

缺血性脑损伤时，产生兴奋毒性，引发脑损伤级联反应，导致神经元细胞损伤甚至死亡［1］。治疗的关键在于挽救缺血半暗带濒临死亡的神经元和促进损伤后神经功能的恢复［2］。重组组织型纤溶酶原激活剂（rt－PA）是唯一经循证医学证实能有效治疗急性缺血性脑卒中的药物。rt－PA 治疗可发生严重的致命性颅内出血的并发症，限制了rt－PA 的应用［3］。

近年来研究证实［4］，人及动物成年脑内有多处部位存在着自我更新和分化潜能的静息态神经干细胞（NSC），可参与修复缺损的神经功能。在成年啮齿类动物和成人脑中有3 个NSC群［2］，1个是位于脑室区和脑室下区（ventricular zone and subventricular zone，VZ and SVZ），另1个在连接侧脑室和嗅球的区域（在成人尚未证实），第3 个是在海马齿状回（dentate gyrus，DG）。NSC的增殖分化受多种生长因子和细胞信使分子的调控［5］。维甲酸是影响细胞增殖分化的信号之一，在脊椎动物中枢神经系统的正常发育中起关键作用［6］。研究表明RA 能够激发脑室区、脑室下区和海马齿状回的神经再生，显著提高多种干细胞分化为神经元［7－10］。利用维甲酸处理短尾猴胚胎干细胞成功地获得运动神经元（表达NFM 和IsletⅠ＋）后植入偏瘫模型小鼠，小鼠的运动功能明显改善［11］。

针灸治疗缺血性脑卒中临床疗效确切，电针足三里、曲池亦可刺激脑室区、脑室下区和海马齿状回的神经增殖、分化，促进脑缺血恢复期神经功能的恢复［12－16］。开展此项研究，以期为针灸的临床应用提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂 Raldh1、Raldh2和β－actin引物（上海生工生物工程有限公司），BCA 蛋白定量试剂盒、SDS－PAGE凝胶配制试剂盒、超敏ECL 化学发光试剂盒（北京碧云天生物技术研究所），Prestained Protein marker（立 陶 宛MBI公 司），PVDF 膜（美国Millipore公司），羊抗Raldh1、羊抗Raldh2（美国Santa Cruz Biotechnoligy公司），鼠抗β－actin、HRP 标记抗小鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.1.2 仪器 Homecage仪器（美国clever system 公司制造），全自 动 酶 标 仪（BioTek），PE－9600 PCR 仪（PE 公 司，美 国），Nicon ECLIPSETE2000－U 倒 置 生 物 显 微 镜，Cool4500 数 码 相机，电泳仪、微型凝胶电泳装置、凝胶成像系统、半干电转移槽、化学发光成像仪（美国Bio－Rad公司）等。

1.2 实验动物与分组 清洁级健康雄性SD大鼠，体重250g±30g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：2007000509570。大鼠144只，随机分为假手术组、模型组、针刺组，各48只。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备 参照Zea－Longa线拴法［17］复制大脑中动脉缺血模型。颈部正中切口，钝性分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。

1.3.2 模型筛选 参照Longa和Bederon 的5 分制评分方法［17，18］评分。1分～3分入选。

1.3.3 实验动物处理 假手术组：仅分离CCA、ECA 及ICA，不结扎、插线。模型组：于缺血再灌后1d、7d、14d、28d各取6只，先进行Homecage Scan行为学检测，之后取梗死侧脑组织用于Western blot检测，另取6只梗死侧脑组织用于PCR 检测。针刺组：穴位取患侧曲池、足三里（大鼠穴位定位参考《实验针灸学》［19］）。应用华佗牌SDZ－Ⅱ型电针治疗仪，电压峰值为6V，以肢体轻轻抖动为度，疏密波，频率（4～20）Hz，每次电针20 min，1次／日。于缺血再灌1d、7d、14d、28d各取6只，先进行Homecage Scan行为学检测，之后取梗死侧脑组织用于Western blot检测；另取6只梗死侧脑组织用于PCR 检测。

1.3.4 观察指标 Homecage Scan行为学检测：在术后1d、7 d、14d、28d，将各组大鼠放入Home cage仪器中进行观测24 h。每一段影像由HomecageScan软件来分析，选取行走、进食、后肢站立、舔毛四个行为进行分析。蛋白免疫印迹法（Western blot）：按BCA 蛋白定量试剂盒说明制作标准曲线并测定蛋白含量，计算出灰度值。RT－PCR检测：利用RT－PCR 两步法试剂盒（TaKaRa公司）说明将mRNA 逆转录成cDNA。

1.4 统计学处理 使用SPSS13.0处理，计量资料以均数±标准差表示，多组计量资料采用单因素方差分析（One－way ANOVA），方差齐者用LSD 法，方差不齐则用Tamhane’s T2法。

2 结 果

2.1 大鼠神经功能评定结果 假手术组大鼠各项Homecage Scan行为学检测均正常；造模各组大鼠均出现明显的瘫痪，且随时间的推移逐渐恢复，具体表现为花费在行走、后肢站立、舔毛三种行为的时间逐渐增加，而耗费在进食上的时间却减少；针刺组在术后7d、14d各项行为学评定与模型组比较有统计学意义（P＜0.05）。详见图1。

图1 不同时间点各组进食、行走、舔毛、后肢站立时间比较

2.2 Raldh1mRNA、Raldh2mRNA 表达及电针对其表达的影响

模型组及针刺组Raldh1mRNA、Raldh2 mRNA 的表达在术后第7天升高，第14天达到高峰，之后表达减少，至第28天趋于正常。针刺组、模型组第7 天、第14 天Raldh1mRNA、Raldh2mRNA的表达同假手术组比较有统计学意义（P ＜0.05），针刺组7d、14d的Raldh1mRNA、Raldh2mRNA 的表达同模型组比较有统计学意义（P＜0.05）。详见图2。

图2 不同时间点各组Raldh1mRNA、Raldh2mRNA 的表达

2.3 Raldh1、Raldh2 蛋白的表达及电针对其表达的影响Raldh1蛋白为一个55KD 的条带，Raldh2蛋白为一个55KD 的双条带。研究发现，Raldh1、Raldh2 蛋白的表达模式与各自mRNA 的表达模式相一致，模型组、针刺组第7 天、第14 天Raldh1、Raldh2蛋白的表达同假手术组比较有统计学意义（P＜0.05）。详见图3。

图3 不同时间点各组Raldh1、Raldh2蛋白的表达

3 讨 论

脑缺血损伤能激活脑内“静息”的NSC，并促进其增殖、迁移和分化，分化的神经元能部分地替代和修复损伤的神经元，从而在一定程度上改善缺损的神经功能［4］。

维生素A 及其有生物活性的衍生物，特别是维甲酸，在脊椎动物发育、细胞分化和维持体内平衡中发挥广泛的效应［20］。体内类维生素A 代谢后可产生RA，RA 进入细胞后，首先与细胞质中维甲酸结合蛋白形成复合物，该复合物进入核内与受体结合，调控一系列基因的表达，诱导海马及脑室下区等部位的NSC增殖、分化为神经元［6－10］。RA 的生物效应主要是由维甲酸受体（RARs和RXRs）介导，通过与RARs和RXRs作用，RA上调了转录因子NeuroD，使P21表达增加，同时增加了酪氨酸激酶（tyrosine kinase，Trk）受体TrkA、TrkB、TrkC 和P75神经营养因子受体的表达，使NSC向神经元分化［21］。RA 还同其他核受体发生作用，通过与甲状腺素受体、维生素D3 受体结合，激活1，25（OH）2D3 及甲状腺激素的释放，起到神经保护作用［22，23］。此外，RA 能够诱导中期因子的表达，对缺血性脑损伤起到保护作用［24］。

维生素A 要通过两次氧化才能转变为RA，首先氧化为视黄醛，然后经视黄醛氧化脱氢酶（Raldhs）催化形成RA。Raldhs有三种：Raldh1，Raldh2 和Raldh3。Raldh3 仅在眼睛、面部及腹侧视网膜和端脑神经节隆起有表达，胚胎发育成熟后，这种酶在肝脏及皮肤也可被检测到，Raldh1 主要存在于背侧视网膜、腹侧中脑及中脑到纹状体的投射纤维，而Raldh2主要存在于脑膜中［25］。

本实验发现，模型组及针刺组Raldh1、2各亚型蛋白及mRNA 的表达在术后第7 天升高，第14 天达到高峰，至第28天趋于正常，针刺组第7、1 4天的Raldh 1、2各亚型蛋白及mRNA 的表达同模型组比较有统计学意义，电针可调控Raldh1、2各亚型蛋白及mRNA 的表达。

为了定量分析神经功能缺损，将缺血性脑卒中大鼠置于HomecageScan系统测试笼中。国外已将该测试系统运用到Huntington病、Prion病和脑出血大鼠模型中［26，27］，相比传统的行为学检测而言，Homecage Scan 系统检测具有以下的优势［28－30］。首先，节约了大量的人力。其次，能够全天候地观测大鼠的行为活动。第三，能够实时反映出动物的行为动作，避免了传统的评测方法中试验人员的人为干扰因素，以及对实验动物的抓取和环境改变等因素对治疗效果的影响。

Homecage Scan行为学检测的数据显示，MCAO 术后，大鼠舔毛、行走、后肢站立这三种行为所耗费的时间呈现递增的趋势，进食方面花费的时间在第7 天突然出现增长，而后逐渐递减。查看相关录像资料后发现：MCAO 术后第1天，处于创伤期的大鼠很少有进食行为；此后数天，偏瘫大鼠在进食时需要耗费比平时多数倍的时间才能抓取到食物，在第28天，针刺组、模型组与假手术组的各项实验结果无明显差异，造成这一结果的原因可能与脑损伤后大鼠的自我修复有关，自我修复主要通过脑水肿的减轻，发芽，突触调整，远隔功能抑制等机制实现［31］。本研究选用鼠龄（8～12）周SD 大鼠作为MCAO 模型，这与缺血性脑卒中患者多为中老年人的事实不符，有可能影响到实验结果的准确性。尽管如此，研究结果显示：针刺组在术后7d、14 d各项行为学评分与模型组比较有统计学意义，这种神经功能方面的改善与Raldh1、2各亚型蛋白及mRNA 的表达上调是一致的，间接地说明了通过调控RA 蛋白及其mRNA 的表达，电针可以改善脑梗死大鼠的神经功能表现。

本研究显示，电针可以改善脑梗死大鼠的神经功能，其机制可能与调控RA 信号途径有关，这为电针治疗缺血性脑卒中提供了实验依据。

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