高压氧辅助干细胞治疗心肌梗死大鼠后心功能效应性研究1）

王彦青，张 红

干细胞移植能保护甚至修复梗死心脏的收缩功能，但是临床试验荟萃结果显示[1]，移植效果不理想，大部分移植细胞不能在受损组织中长期存活[2]。心肌梗死早期，体内免疫炎症反应强烈，局部恶劣的缺血缺氧性微环境是移植干细胞在心肌受损组织大量死亡的根本原因[3]。目前临床上基于高压氧能够激发机体的内源性保护机制，减轻全身及局部的炎症反应、调节免疫功能，改善细胞的有氧代谢，而广泛应用于改善脑、脊髓及组织缺血缺氧性治疗。本研究观察高压氧辅助人脐带华通胶间充质干细胞移植心肌梗死大鼠后干细胞的存活增殖、心肌细胞分化及心脏功能改善情况，以明确高压氧是否能够改善移植干细胞治疗大鼠心肌梗死的治疗效应。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 健康清洁雄性SD大鼠（体重250g～300 g），购自宁波大学动物实验中心。利用随机数字表进行随机化分组，分为假手术组（20只）、心肌梗死（AMI）组（20只）、干细胞（MSCs）组（15只）、高压氧（HBO）组（15只）、干细胞组移植＋高压氧（MSCs＋HBO组15只），每个检测时间点均为5只。

1.2 人脐带华通胶间充质干细胞的分离培养 新生儿脐带由我院妇产科提供（胎龄37周～40周），采用Ⅱ型胶原酶（Gibco公司，美国）消化法提取华通胶间充质干细胞，贴壁法无菌培养至三代，用肝素盐水（浓度为62.5U／mL）洗涤3遍重悬细胞配制成干细胞悬液（10～15）mL，细胞数（6±0.3）×105，活细胞比例98%。留置Edu标记。

1.3 人脐带华通胶间充质干细胞Edu标记 严格按Edu染色试剂盒（广州锐博生物科技有限公司，RN：R11053.2）说明进行，用细胞培养基按1 000∶1稀释Edu溶液（广州锐博生物科技有限公司，RN：R11053.2），制备适量50μM Edu培养基，加入干细胞悬液孵育2h，弃培养基，PBS清洗细胞（1～2）次，每次5min，留置移植备用。

1.4 大鼠心肌梗死模型的建立及细胞移植 参照文献方法[4]，复制急性心肌梗死大鼠动物模型。假手术组大鼠左冠状动脉前降支穿线但未进行结扎手术，其余操作同模型组。于心肌梗死模型建立后第3天，大鼠二次开胸，可见梗死区心肌颜色稍白，将Edu标记的人脐带华通胶间充质干细胞移植细胞悬液，细胞数（6±0.3）×105，沿梗死心肌周边0.5cm区域内，4个点自心外膜心肌注射，每点0.1mL，注射深度2mm左右，关胸。

1.5 高压氧治疗 心肌梗死模型建立后1d～30d，每日以0.2ATA／min注入纯氧，至压力达到2.0ATA。当压力稳定后，将大鼠放置60min。达到规定时间以0.2ATA／min排放舱内氧气，至舱内压力恢复至正常。

1.6 心脏组织标本留取 大鼠麻醉状态下，心腔内注射10%KCl溶液1mL，使心脏停于舒张期，迅速取出心脏，垂直心脏长轴将其平分3段，每段心肌部分置入4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，垂直心脏长轴连续切片，厚度4μm，留置免疫荧光检测。

1.7 移植细胞存活及繁殖情况 从每个心脏标本上、中、下3段中取4μm石蜡切片，严格按edu试剂盒说明（广州锐博生物科技有限公司）进行edu免疫荧光检测，染色后采用共聚焦显微镜（TCS－SP5型，Leiea公司，德国）观察，分别用555nm 激发EdU－Apollo®567和350nm激发Hoechst 33342荧光染料，并采用Image－Pro plus 6.0软件进行细胞增殖计数分析，依据细胞增殖率＝增殖细胞数（红色（EdU－Apollo®567））／细胞总数×100%进行计算。

1.8 心肌肌钙蛋白表达检测 进行双标免疫荧光染色，心脏石蜡切片，脱蜡，2mg／mL甘氨酸清洗10min，加入100μL渗透剂（0.5%Triton X－100的PBS）脱色摇床孵育10min，PBS清洗加入100μL的1XApollo®染色反应液，避光、室温孵育30 min后，弃染色反应液。分别滴加1∶1 000稀释兔抗鼠心肌Tn－T作为一抗4℃过夜，阴性对照用PBS代替一抗。分别同时加入100μL 1XHoechst 33342染色反应液、异硫氰酸荧光素标山羊抗兔IgG，避光，室温孵育45min后，弃染色反应液。PBS清洗3次，洗脱反应液。染色后采用共聚焦显微镜（TCS－SP5型，Leiea公司，德国）观察，分别用555nm激发EdU－Apollo®567和350nm 激发 Hoechst 33342荧光染料，并采用Image－Pro plus 6.0软件进行。

1.9 超声心动图评价心脏结构及功能 评价指标包括左室舒张末期容积（LVSV）、收缩末容积（LVDV）、左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（FS）及每搏输出量（SV）。

1.10 统计学处理 应用SPSS15.0软件分析。定量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用成组资料的t检验。

2 结 果

2.1 人脐带华通胶间充质干细胞培养及Edu标记情况 人脐带华通胶间充质干细胞在接种后2h开始贴壁，3d开始分散存在的细胞克隆，呈长梭形，10d细胞集落达90%融合，消化传代的细胞于24h贴壁，呈漩涡状或平行状排列，平均3d再次传代，3代以后的干细胞纯度达95%。Edu染色结果显示，第三代干细胞增殖能力接近100%。

2.2 移植细胞存活及增殖情况 干细胞移植后第4周，高压氧＋干细胞组与干细胞组比较，心肌组织局部干细胞存活增殖率显著增高（276.6±73.8vs 20.5±12.3，P＜0.01）。

2.3 心肌细胞肌钙蛋白T表达情况 干细胞移植后第4周，高压氧＋干细胞组与干细胞组比较，干细胞在心肌组织局部肌钙蛋白表达显示增加。

2.4 干细胞移植后第4周各组心功能状况 与正常大鼠相比，心肌梗死后第4周，舒张末容积及收缩末容积显著增高（P＜0.01），左室射血分数、左室短轴缩短率、每搏输出量显著降低（P＜0.01）。心肌梗死后4周，与心肌梗死组比较，HBO、MSCs、MSCs＋HBO组较AMI组心功能各指标均有不同程度改善，其中改善最为显著者为 MSCs＋ HBO组（P＜0.01），除外舒张末容积变化（P＞0.05）。详见表1。

表1 干细胞移植后第4周各组心功能状况（±s）

表1 干细胞移植后第4周各组心功能状况（±s）

指标 假手术组 AMI组（3d） AMI组（4W） HBO组（4W） MSCs组（4W） MSCs＋HBO组（4W）LVSV（mm） 0.64±0.17 0.69±0.18 1.10±0.421） 0.95±0.07 0.80±0.12 0.80±0.241）LVDV（mm） 0.10±0.07 0.19±0.09 0.50±0.041） 0.45±0.02 0.33±0.13 0.17±0.091）LVEF（%） 80.00±10.76 70.98±8.29 58.20±3.011） 58.30±6.79 64.0±11.40 72.96±5.712）FS（%） 43.50±1.56 36.04±6.26 24.60±3.891） 28.70±1.56 31.05±7.84 37.38±4.612）SV（mL） 0.60±0.02 0.47±0.12 0.45±0.061） 0.48±0.14 0.50±0.00 0.67±0.142）与假手术组，1）P＜0.01；与AMI组（4周）比较，2）P＜0.01。

3 讨 论

有效促使干细胞靶向迁移至受损组织，提高其在受损组织局部的存活率，并能定向分化为功能细胞，是提高干细胞移植效率的前提和关键。有学者将干细胞比拟为人体真正的“生物组织工程师”，是环境依赖化的，局部微环境对干细胞的存活、分化起决定性作用[2]。急性心肌梗死早期局部恶劣的缺血缺氧性微环境是移植干细胞在心肌受损组织大量死亡的根本原因[3]。氧作为细胞生存及新陈代谢的重要影响因素，其分压及浓度对间充质干细胞的增殖能力具有重要的影响[5]。Peng等[6]在高压氧预处理神经干细胞缺血缺氧模型中发现，高压氧处理可逆转缺血缺氧对神经干细胞的损伤，增加神经干细胞的数目与活力，并促进神经干细胞向神经元的分化，加速脑损伤的康复；而单纯高浓度氧和高气压处理均不能有效地促进神经干细胞增殖与分化，这种增强促进不是无限制的，因此不会导致其他诱导机制导致的干细胞成瘤的发生。高压氧同样能够通过增强干细胞在梗死心肌组织的存活增殖率，而在干细胞治疗急性心肌梗死有重要协同作用。

本研究发现，干细胞移植后4周，高压氧辅助干细胞治疗组，干细胞的存活增殖率较单纯干细胞治疗组显著增强，且心肌组织细胞心肌钙蛋白T表达显著增强，提示高压氧可促进干细胞在梗死心肌组织局部分化为心肌细胞，分化的心肌细胞是否有助于梗死后心脏功能改善，本研究结果显示，在干细胞移植4周后，高压氧辅助干细胞组除舒张末容积外，其收缩功能、射血分数均显著改善，这表明高压氧辅助干细胞治疗心肌梗死能够显著改善梗死后心脏功能的恢复，它应是干细胞治疗急性心肌梗死的一项有效的辅助措施。

[1]Atta B，Satsuki Y，Ruben CD，etal.Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction[J].Am Coll Cardiol，2010，56：721－734.

[2]Husnain KH，Muhammad A.Strategies to promote donor cell survival：Combining preconditioning approach with stem cell transplantation[J].J Molecular Cell Cardiology，2008（45）：554－566.

[3]Nicolle K，Gaia S，Silvia A，etal.Targeting stem cell niches and trafficking for cardiovascular therapy[J].Pharmacol Ther，2011，129（1）：62－81.

[4]杨钰萍，沈祥春，刘兴德，等.氧化苦参碱对急性心肌梗死诱发实验性大鼠心肌重塑的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（6）：125.

[5]Tatyana N，Milovanova VM，Bhopale EM，etal.Hyperbaric oxygen stimulates vasculogenic stem cell growth and differentiation in vivo[J].J Appl Physiol 2009（106）：711－728.

[6]Peng ZR，Wang SE，Xiao PT.Effect of hyperbaric oxygen on the differentiation of brain derived neural stem cells[J].J Clin Rehabilitative Tissue Engineering Research，2007，11（3）：427.