高、中、低筋力小麦胚乳不同部位蛋白体积累研究

熊 飞 周 亮 余徐润 王 忠

(扬州大学生物科学与技术学院，扬州 225009)

小麦是世界上种植面积最大、贸易量最大的粮食作物，我国小麦种植面积仅次于水稻，约占粮食作物种植面积的27%［1］。小麦胚乳在发育过程中合成大量的贮藏蛋白既是早期种子萌发的重要能量来源，也是人类植物蛋白的重要来源［2－3］。胚乳蛋白质由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白组成，其中前两者为代谢蛋白，约占籽粒蛋白质总量的20%，决定小麦的营养品质，后两者为种子贮藏蛋白，约占籽粒蛋白质总量的80%左右，决定小麦的加工品质［4－5］。

小麦胚乳蛋白体是积累蛋白质的细胞器，蛋白体发育的好坏直接影响小麦的产量和品质［6］。有研究表明［7－8］，小麦胚乳细胞中的蛋白体约在花后第8～9天出现。小麦蛋白体出现的时间与品种特性和气温有关，蛋白体随胚乳细胞充实而增大，多个小蛋白体相互融合形成大的蛋白体。

关于小麦贮藏蛋白体的形成有2种不同的观点，即通过高尔基体形成蛋白体［9－10］还是通过内质网衍生出蛋白体［8］。许多研究表明［11－15］，在小麦胚乳发育及养分输入时，蛋白质在粗内质网上合成，浓缩于高尔基体中，由高尔基体产生的富含蛋白质的高尔基体小泡从高尔基体上脱落下来，在细胞质中相互融合或被液泡胞溶成为蛋白体［6］。Parker［16］认为当蛋白体出现时高尔基体就开始分泌电子不透明小泡。Kim等［9］通过麦醇溶蛋白的定位表明，高尔基体参与了小麦蛋白体的形成，高尔基体分泌的电子浓密小泡含有麦醇溶蛋白，这些浓密小泡与大的电子透明小泡或液泡相连，有些浓密小泡在细胞质中相互融合形成大的蛋白颗粒，然后进入蛋白质贮藏液泡。

前人的研究大多集中在对单个小麦品种胚乳蛋白体发生及发育的研究［6，8－10］，而且对蛋白质积累的研究大多是基于籽粒干物质积累和转运、籽粒成分和相关酶活性等指标分析上［2，4］，而从微观结构对不同专用小麦胚乳不同部位的蛋白质积累的研究较少。本研究以不同面筋强度的小麦为试验材料，对品种间及胚乳腹部和背部蛋白体积累的差异进行了比较研究，旨在为我国小麦品种的品质改良和加工利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

高筋小麦徐麦30、中筋小麦扬麦11、低筋小麦扬麦13:国家小麦改良中心扬州分中心。

1.2 试验设计

试验于2011～2012年在扬州大学江苏省作物栽培生理重点实验室试验场进行，条播，随机区组排列，重复3次。

1.3 颖花标记

在开花期用记号笔点颖和植株挂牌相结合的方法正确标记颖花的开花时间，标记的颖花均为穗中部小穗基部的2朵花，在盛花期同一天挂牌标记开花时间。

1.4 树脂切片样品的制备

于花后8、11、14、17 d采集大小一致的颖果，取中部2 mm横断置于2.5%GAL(戊二醛)前固定3 h，再经乙醇系列脱水，环氧丙烷置换，用低黏性的Spurr树脂浸透与包埋。用Leica超薄切片机切取1 μm厚的半薄切片。

1.5 半薄切片与光镜染色观察

用1% 甲苯胺蓝(TBO)染色5 min，在 Leica DMLS光学显微镜下观察并拍照，拍摄的照片放大倍率均为200倍。

1.6 扫描电镜样品制备与观察

选取成熟干燥的饱满籽粒，用镊子夹住两端，使其自然断裂，选取断面完整且平整的材料，用双面胶带将样品粘在样品台上(使籽粒的断裂面大致在同一水平面上)，离子溅射镀金后于扬州大学测试中心环境扫描电子显微镜(PhilipsXL－30 ESEM)下观察并拍照。

1.7 蛋白体的参数测量

选取有代表性的小麦颖果4个，每个颖果腹部和背部(图1)选取了10张光学显微镜拍摄的照片，从光学显微镜拍摄的照片上选取40个胚乳细胞，采用Image－Pro Plus软件测量颖果断面蛋白体的面积并进行统计分析。数据采用SPSS 19.0软件进行显著性检验和方差分析。

图1 小麦颖果胚乳腹部和背部

2 结果与分析

2.1 高、中、低筋小麦腹部胚乳细胞蛋白体积累的差异

花后8 d高、中、低筋小麦腹部胚乳细胞中开始积累小蛋白体，较分散的分布在胚乳细胞中(图2a1，图2b1，图2c1)，但不同品种间蛋白体面积及数目无显著差异(图3)。花后11 d胚乳细胞中蛋白体增多，其中高筋小麦胚乳细胞中小蛋白体互相融合形成大蛋白体，细胞内蛋白体面积徐麦30＞扬麦11＞扬麦13(图2a2，图2b2，图2c2)。花后14 d胚乳细胞内小蛋白体大量增加同时其融合形成的大蛋白聚集体增多，面积徐麦30＞扬麦11＞扬麦13(图2a3，图2b3，图2c3)。花后17 d胚乳细胞内蛋白体积累值达到高峰，随着胚乳淀粉粒的逐渐增多，蛋白体被挤压到淀粉粒间隙中，蛋白体大小和数目显著增加，但不同品种间差异不显著(图2a4，图2b4，图2c4)。

图2 小麦颖果腹部胚乳细胞蛋白体的发育

从胚乳细胞内蛋白体的面积变化可知(图3)，花后8～17 d，高、中、低筋小麦腹部胚乳细胞蛋白体面积呈现先慢后快的积累变化，其中8、11、14 d蛋白体面积品种间差异显著，表现为徐麦30＞扬麦11＞扬麦13，而花后17 d蛋白体面积值无显著差异。这说明不同品种小麦蛋白体的积累量的差异主要表现在发育早期即灌浆高峰期，后期差异小。

图3 小麦颖果腹部蛋白体面积的变化

2.2 高、中、低筋小麦背部蛋白体积累的差异

由图4可知，花后8 d高、中、低筋小麦背部胚乳细胞内蛋白体较少，呈零星分布，品种间细胞断面内蛋白体总面积也无显著差异(图4a1，图4b1，图4c1，图5)。花后11 d背部胚乳细胞内蛋白体增多，其中徐麦30、扬麦11蛋白体积累量高于扬麦13(图4a2，图4b2，图4c2)。花后14 d蛋白体积累量显著增加，徐麦30胚乳细胞内出现了较多的蛋白聚集体，同时其蛋白体面积高于扬麦11和扬麦13，差异显著(图4a3，图4b3，图4c3)。花后17 d，蛋白体积累达到高峰，胚乳细胞内出现了许多大蛋白体和蛋白聚集体(图4a4，图4b4，图4c4)，受淀粉粒积累的影响，徐麦30胚乳细胞内蛋白体被挤压出现一定程度的变形，而蛋白体大小品种间表现为徐麦30＞扬麦11＞扬麦13。

图4 小麦颖果背部胚乳细胞蛋白体的发育

从蛋白体面积变化趋势可知(图5)，花后8、11、14、17 d不同品种间蛋白体积累总量徐麦30＞扬麦11 ＞ 扬麦13，差异主要表现在11、14、17 d，其中11 ～17 d为背部胚乳细胞蛋白体的快速积累期。

图5 小麦颖果背部蛋白体面积的变化

2.3 小麦颖果腹部和背部蛋白体积累的差异

图2和图4显示高、中、低筋力小麦胚乳腹部和背部蛋白体积累的差异。以中筋力扬麦11为例，花后8 d背部胚乳细胞中蛋白体较少，而腹部胚乳细胞中已经积累了较多的蛋白体(图2b1，图4b1)。花后11 d背、腹部胚乳细胞中蛋白体显著增加，腹部胚乳细胞中出现了较多的蛋白聚集体，蛋白体面积腹部高于背部，差异显著(图2b2，图4b2)。花后14 d腹部胚乳细胞中出现了较多的大蛋白体和蛋白聚集体，而背部胚乳细胞中较少(图2b3，图4b3)。花后17 d随着胚乳细胞的逐渐充实，背部、腹部胚乳细胞中均出现了较多的大蛋白体，腹部较多，而蛋白体面积腹部显著高于背部(图2b4，图4b4)。

由图6可知，8～14 d为蛋白体的缓慢增长期，蛋白体面积腹部高于背部。14～17 d为蛋白体的快速增长期，蛋白体面积差异较大，腹部显著高于背部。以上数据综合表明，对于中筋小麦扬麦11而言，颖果腹部胚乳细胞蛋白体积累量高于背部，蛋白体积累速率经历了从慢到快的积累过程。

图6 扬麦11颖果背、腹部蛋白质面积的变化

2.4 小麦成熟籽粒蛋白体分布的差异

图7为高、中、低筋小麦成熟籽粒断面扫描电镜图。从图7可知，成熟籽粒胚乳细胞中淀粉粒含有大小淀粉2种形态，大淀粉粒呈椭圆形或饼形，小淀粉粒呈圆球形。不同品种间以强筋小麦蛋白体基质分布稍多，充实在淀粉体间隙(图7a)，被挤压程度较高，而低筋小麦蛋白体基质较少，其淀粉体之间还存在较多空隙(图7c)，中筋小麦蛋白体分布形态介于两者之间，差异不大(图7b)。

图7 小麦成熟籽粒蛋白体和淀粉粒的分布

3 讨论

本试验结果显示，在小麦颖果发育过程中，高筋小麦腹部和背部胚乳细胞中蛋白体面积最高，中筋小麦次之，低筋小麦最低。这从微观结构角度进一步验证了不同面筋强度的小麦蛋白质积累的差异［2］。花后8 d胚乳细胞开始积累蛋白体，但品种间无显著差异，而到花后11、14 d时差异达到显著，高筋小麦胚乳细胞中蛋白体面积保持快速增长的趋势，中筋和低筋次之，而到17 d蛋白体面积值无显著差异。小麦胚乳细胞中积累的贮藏蛋白质主要是麦醇溶蛋白和谷蛋白［17］。醇溶蛋白基因位点是一个复合位点，每个位点都编码数个甚至十多个等位亚基，编码醇溶蛋白的基因位于第1、6部分同源染色体短臂上的 Gli－1、Gli－2 位点上［18］，麦谷蛋白分为高分子质量麦谷蛋白亚基(HMW－GS)和低分子质量麦谷蛋白亚基(LMW－GS)，前者由位于第一同源组群染色体长臂的Glu－A1、Glu－B1和Glu－D1位点的基因编码，而后者由位于短臂上的Glu－A3、Glu－B3和 Glu － D3 位点的基因编码［19－20］。从分子角度上分析，我们推测不同专用小麦贮藏蛋白质含量的差异与这些基因表达量有关。

本试验结果表明，胚乳不同部位积累蛋白体的数量和大小不同，一般认为，亚糊粉层蛋白体积累早且数目多，而胚乳中部蛋白体分布较少［21］。本研究将胚乳不同部位划分成背部和腹部(图1)，发现胚乳细胞中蛋白体面积腹部高于背部，而且腹部胚乳细胞中含有较多的大蛋白体，推测这种差异的形成可能与不同部位胚乳细胞发育及灌浆物质的输入途径差异有关。王忠等［6］认为，来自筛管的灌浆物质经珠心突起卸载至灌浆“池”，而后由2条途径进入胚乳，一条是经灌浆“池”边的传递细胞进入胚乳，一条通过胚乳外围的糊粉层细胞进入胚乳。小麦颖果腹部离“灌浆池”近，糊粉层细胞集中，所以氮基酸等灌浆物质充足，因此合成的蛋白体多而大，而背部糊粉层离“灌浆池”远，氨基酸等灌浆物质运输距离远，因此背部胚乳灌浆物质少，蛋白体积累少，面积小。

本试验选用胚乳发育时期为花后8～17 d，此时期为籽粒灌浆的高峰期。由于此时期蛋白体在胚乳细胞中积累较少，受淀粉粒积累影响程度较低，从微观结构上容易观察蛋白体的发育及积累过程，因此，本研究所选时期可真实反映胚乳细胞蛋白体发育及积累的动态规律。而在颖果发育后期，由于淀粉粒的大量积累，将蛋白体挤压在淀粉粒空隙之间，蛋白体的大小及面积都会发生变形，因此从微观上观察蛋白体的发育过程以及用Image－Pro Plus软件测量蛋白体的面积已不再适宜。

4 结论

不同筋力小麦腹部和背部蛋白体发育存在明显差异。品种间在腹部和背部蛋白体积累量表现为徐麦30＞扬麦11＞扬麦13，尤以花后11、14 d突出;同一品种胚乳腹部和背部蛋白体积累量表现为腹部＞背部，且差异显著。

［1］赵继新，武军，陈新宏，等.黄淮麦区部分小麦新品系高分子量谷蛋白亚基的组成研究［J］.安徽农业大学学报，2008，35(2):284 －288

［2］Richard G M，Turner P F，Napier J A.Transport and deposition of cereal prolamins［J］.Plant Physiology and Biochemistry，1996，34:237 －243

［3］Kumamaru T，Ogawa M，Satoh H，et al.Protein body biogenesis in cereal endosperms［C］.Plant cell Monogr:Endosperm.Heidelberg:Springer－Verlag Berlin，2007:141 －158

［4］Shewry P R，Halford N G.Cereal grain storage proteins:structures，properties and role in grain utilization ［J］.Journal of Experimental Botany，2002，53:947 －958

［5］Shewry P R，Napier J A，Tatham A S.Grain storage proteins:structures and biosynthesis［J］.The Plant Cell，1995(7):945－956

［6］王忠，顾蕴洁，李卫芳，等.小麦胚乳发育及其养分输入的途径［J］.作物学报，1998，24(5):536－543

［7］周如美，张永泰，李爱明，等.孕穗期施氮对小麦蛋白质组分积累和蛋白质体发育的影响［J］.麦类作物学报，2009，29(6):1022－1026

［8］韦存虚，张军，周卫东，等.小麦胚乳发育过程中贮藏蛋白的积累和蛋白体的形成［J］.麦类作物学报2009，29(1):73－78

［9］Kim W T，Franceschi V R，Krishnan H B，et al.Formation of wheat protein bodies:involvement of the Golgi apparatus in gliadin transport［J］.Plants，1988，173:173 －182

［10］Loussert C，Popineau Y，Mangavel C.Protein bodies ontogeny and localization of prolamin components in the developing endosperm of wheat caryopses［J］.Journal of Cereal Science，2008，47:445 －456

［11］Bechtel D B，Gaines R L，Pomeranz Y.Protein secretion in wheat endosperm:formation of the matrix protein［J］.Cereal Chemistry，1982，59(5):336 －343

［12］Krishnan H B，White J A，Pueppke S G.Immunocytochemical localization of wheat prolamins in the lumen of the rough endoplasmic reticulum［J］.Cananian Journal of Botany，1991，39:2574 －2577

［13］Levanony H，Rubin R，Altschuler Y，et al.Evidence for a novel route of wheat storage proteins to vacuoles［J］.Journal of Cell Biology，1992，119:1117 －1128

［14］Rubin R，Levanony H，Galili G.Evidence for the presence of two different types of protein bodies in wheat endosperm［J］.Plant Physiology，1992，99:718 －724

［15］Galili G，Altschuler Y，Levanomy H，et al.Assembly and transport of wheat storage proteins［J］.Journal of Plant Physiology，1995，145:626 －631

［16］Parker M L.Protein body inclusions in developing wheat endosperm［J］.Annals of Botany Company.1980，46:29 －36

［17］田纪春.优质小麦［M］.济南:山东科学技术出版社，1995，13 －63，108 －171

［18］王聪艳，周志国.小麦醇溶蛋白的研究进展［J］.江苏农业科学，2009(4):22－24

［19］Payne P I.Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation of bread － making quality［J］.Annual Review of Psychology，1987，38:141 －153

［20］Singh N K，Shpherd K W.Linkage mapping of the genes controlling endosperm proteins in wheat:1.Genes on the short arms of group 1 chromosomes［J］.Theoretical and Applied Genetics，1988，75:628 －641

［21］Peter R Shewry，Rowan A C，Mitchell，et al.An integrated study of grain development of wheat(cv.Hereward)［J］.Journal of Cereal Science，2012，56:21 －30.