微波辅助碱法降解黄曲霉毒素工艺对米蛋白品质的影响

王 勇 赵秀平 王 韧 王 莉罗小虎 唐小俊 魏振承 张名位 陈正行

(江南大学食品学院粮食发酵工艺与技术国家工程实验室食品科学与技术国家重点实验室1，无锡 214122)

(广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所2，广州 510610)

米蛋白因其氨基酸配比合理、生物价高、蛋白质效用比率高以及低过敏性等特点，被营养界公认为优质植物蛋白质［1］。但由于稻谷在田间、贮藏和加工等环节容易染上黄曲霉和寄生曲霉等而产生黄曲霉毒素，导致米制品(如米蛋白)中黄曲霉毒素含量不符合国家标准(≤10 μg/kg)。在发霉严重的情况下，稻米将被销毁，给相关企业和部门造成巨大的经济损失［2－3］。因此，有效降解发霉稻米中的黄曲霉毒素逐步成为提高粮食利用率、保护粮食的重要措施之一。

在实际生产过程中，通常采用传统碱法工艺制备高回收率、高纯度米蛋白［4］。经研究发现［5］，以添加不同黄曲霉毒素B1(AFB1)初始浓度(20、40、60、80和100 μg/kg)的加标染毒稻米为原料，传统碱法所制备的米蛋白中AFB1残留浓度均超标;然而，在碱法制备米蛋白的基础上，经优化，采用单位体积微波功率750 W/L对不同AFB1初始浓度的米蛋白上清液分别辅助处理 0.2、3.1、5.6、7.2 和 8.6 min，所制备的米蛋白中 AFB1残留浓度(8.71、9.97、9.90、9.95 和9.94 μg/kg)均符合国标。上述微波辅助碱法降解AFB1的有效性已得到验证，但降解后其对米蛋白品质的影响仍需进一步研究。

微波是一种频率介于300 MHz与300 GHz之间的电磁波，能够引起极性分子振动从而对食品物料产生影响，作为一种新型非热技术被逐步广泛应用于食品加工过程中［6］。微波对蛋白功能性质的影响显著，国内外对此有大量的研究［7－10］。本试验选取米蛋白的回收率及纯度、溶解性、乳化性、起泡性、持水性和持油性等基本性质与功能特性作为检测指标，评估微波辅助碱法降解AFB1过程中微波对米蛋白品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

稻米样品:市售，研磨粉碎过80～100目，筛下物密封，4℃冷藏，经测定，蛋白质6.28%(干基);AFB1标品:纯度 ＞99.0%，Alexis;MycosepTM226 MFC:Romer Labs;Folin－酚乙试剂:Sigma;胰蛋白酶:丹麦Novozyme公司。

华烨HYP－1 020定氮消化炉:上海纤检仪器有限公司;FJ－200高速分散均质机:上海标本模型厂;MZG1 500S型微波实验仪:南京汇研微波系统工程有限公司;FreeZone型冷冻干燥机:Labconco公司;高效液相色谱仪Agilent 1260 Infinity(荧光检测器，激发波长200～700 nm，发射波长280～900 nm):Agilent公司;MAPADA UV－1800紫外分光光度计:上海美谱达仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 微波辅助碱法制备无毒米蛋白优化工艺

加标染毒稻米(AFB1初始浓度分别为20、40、60、80 和100 μg/kg)以料液比 1∶8 浸入 0.06 mol/L NaOH溶液中，不断搅拌60 min，8 000 r/min离心10 min取上清液;采用单位体积微波功率750 W/L对不同 AFB1初始浓度的上清液分别处理 0.2、3.1、5.6、7.2 和8.6 min，冷却至室温;调 pH 6，滴加过量 α －淀粉酶反应1 h酶解上清液中残留的淀粉，再调pH 4.6，灭酶、酸沉，离心取沉淀，水洗2次，冷冻干燥，得到米蛋白制品。经测定［11］，所得到的米蛋白制品中AFB1残留浓度均符合国标。

1.2.2 米蛋白回收率及纯度的测定

采用微量凯氏定氮法［12］测定稻米及米蛋白制品中蛋白质含量，米蛋白回收率及纯度表达式如下:

回收率R/%=(米蛋白制品含量×P)/稻米中总蛋白质含量×100

纯度P/%=米蛋白制品蛋白测定含量/米蛋白制品含量×100

1.2.3 米蛋白功能特性及营养性质的测定

1.2.3.1 米蛋白溶解度的测定［13］

采用Lowry法。米蛋白样品研磨后过80目筛，以pH 7.0的0.05 mol/L磷酸二氢钾－氢氧化钠缓冲液配成10 g/L的浓度，25℃电磁搅拌1 h，6 000 r/min离心10 min，用Lowry法在分光光度计640 nm处测定上清液的OD值，先获得牛血清白蛋白的标准曲线，再测定上清液中蛋白质含量。米蛋白样品总蛋白质含量使用微量凯氏定氮法测定。米蛋白溶解度用氮溶解度指数NSI表示，表达式如下:

氮溶解度指数NSI/%=上清液中蛋白质含量/米蛋白样品总蛋白质含量×100

1.2.3.2 米蛋白乳化性的测定［14］

采用浊度法。取1 g/L浓度的蛋白溶液63 mL于250 mL烧杯中，加入27 mL大豆色拉油;用高速分散均质机在12 000 r/min转速下分散2 min;用注射器从底部取0.1 mL乳状液，迅速与5 mL 1 g/L SDS溶液混合均匀，在500 nm波长下比色，记录吸光度(E0);10 min后再从底部取0.1 mL乳状液，同样稀释，比色，记录吸光度(Et)。蛋白质的乳化能力以乳化能力指数E0和乳化稳定性指数ESI表示，其中:

ESI/min=E0×t/(E0－Et)

1.2.3.3 米蛋白起泡性的测定［15－16］

用0.05 mol/L磷酸二氢钾－氢氧化钠缓冲液(pH 7.0)配成1 g/L米蛋白样品，取100 mL用高速分散均质机在10 000 r/min转速下分散2 min;转入250 mL量筒，迅速记录溶液与泡沫总体积V0，将上述体系静置30 min后，测出下层析出液的体积Vt。

起泡性FC/%=(V0－100)/100×100

起泡稳定性/%=Vt/V0×100

1.2.3.4 米蛋白持水、持油能力的测定［1，16］

持水性:准确称取蛋白质样品W0于50 mL离心管中，加入10 mL去离子水，用漩涡混合器混匀，然后4 500 r/min离心15 min，倾去上清液，将离心管斜置 30 min，称重 Wt。

持油性:准确称取大米蛋白样品W0于50 mL离心管中，加入5 mL大豆色拉油，用漩涡混合器混匀，然后4 500 r/min离心15 min，吸去上层未吸附油，称重Wt。

持水能力(持油能力)/g=(Wt－W0)/W0

1.2.4 试验数据分析

试验重复3次，采用OriginPro 9.0作图和SPSS 17.0进行ANOVA方差分析(Tukey分析均值差异的显著性，显著水平P≤0.05)。

2 结果与分析

2.1 微波对米蛋白回收率及纯度的影响

本研究中，每组投料量为1 L，考察单位体积微波功率750 W/L处理不同时间对米蛋白回收率及纯度的影响。如图1所示，与碱法制备米蛋白相比，微波辅助碱法制备米蛋白的回收率(F=1.889，P=0.542 ＞0.05)及纯度(F=2.378，P=0.209 ＞0.05)变化不显著，回收率为77.34%～78.57%，纯度为93.71%～94.35%，表明微波对米蛋白回收率及纯度的影响不大。

图1 微波对米蛋白回收率及纯度的影响(n=3)

2.2 微波对米蛋白溶解性的影响

溶解度是蛋白质的基本物理性质之一，会影响蛋白质的其他功能性质及实际应用价值。在高频微波场中，蛋白质极性分子与水分子变成有序极性分子并且发生高速的振荡、碰撞、摩擦和挤压作用，产生巨大的热量，引起蛋白质等极性分子基团电性质变化，从而使蛋白质功能性质发生变化［18］。如图2所示，相比碱法制备米蛋白，经微波辅助碱法制备米蛋白的溶解性显著增强;随着微波处理时间的延长，米蛋白溶解性也不断提高，当微波处理时间超过7.2 min时，米蛋白溶解性变化不显著。蛋白质的溶解性与其表面疏水与亲水作用有很大的关联。由于微波的热效应，蛋白分子之间发生了交联，蛋白小分子聚合成大分子，而且交联部位很可能集中于疏水基团，以至于米蛋白亲水性提高，溶解性提高。这与国内外研究人员对此所做的相关研究不尽相同。熊犍等［8］研究表明，随着微波功率和微波处理时间的增加，大豆蛋白的溶解性先提高后下降，而Hafez等［9］认为微波可使大豆蛋白的溶解性显著下降。这可能是由于大豆分离蛋白亲水性强，微波处理使蛋白质亲水基团交联，疏水基团暴露得更多，从而导致溶解性下降。

图2 微波对米蛋白溶解性的影响(n=3)

2.3 微波对米蛋白乳化性的影响

乳化性是蛋白质的重要功能之一，是指蛋白质将油和水结合形成油水乳状液保持稳定的能力，具体包括乳化性和乳化稳定性2个方面［1］。由图3可知，在0～3.1 min，随着微波处理时间的延长，米蛋白的乳化性和乳化稳定性逐渐增强，处理3.1 min时米蛋白的乳化性和乳化稳定性最强，但随着微波处理时间的进一步延长，其乳化性和乳化稳定性呈下降趋势。微波场诱导米蛋白分子产生极化现象，维持蛋白空间结构的非共价键被破坏，蛋白分子部分展开，分子柔性提高，更多的分子结合到油－水界面;同时，蛋白分子内部的疏水残基暴露在蛋白表面，其表面疏水性增强，故米蛋白的乳化性和乳化稳定性增强。但是，当微波处理时间进一步延长时，蛋白分子进一步展开，极化的蛋白分子之间相互吸引，通过非共价键重新形成大分子聚集体，分子柔性降低，表面疏水性减弱，故乳化性及乳化稳定性呈下降趋势。

图3 微波对米蛋白乳化性的影响(n=3)

2.4 微波对米蛋白起泡性的影响

起泡性是指蛋白质搅打起泡的能力，而起泡稳定性则是泡沫保持稳定的能力。由图4可知，微波辅助处理可提高米蛋白起泡性，但是随着微波处理时间的延长其起泡稳定性先提高后下降。微波场诱导米蛋白分子产生极化现象，非共价键被破坏，蛋白分子部分展开，其内部的疏水残基暴露在蛋白表面，促进蛋白分子间相互作用和水－空气界面的形成，形成更稳定的二维网络结构和界面膜，故起泡性和起泡稳定性增强。但随着微波处理时间进一步延长，蛋白分子进一步展开，其内部的疏水基团和巯基进一步暴露，极化的蛋白分子之间通过非共价键重新形成分子聚集体，水－空气界面膜的稳定性下降，因此起泡稳定性呈下降趋势［19］。

图4 微波对米蛋白起泡性的影响(n=3)

2.5 微波对米蛋白持水性、持油性的影响

蛋白质的持水性、持油性是食品储藏及加工过程中非常重要的指标［16］。由图5可知，微波处理可明显降低米蛋白的持水能力，但可提高米蛋白的持油能力。微波加热使米蛋白变性进而聚集成大分子聚合体，从而减少米蛋白的比表面积和极性基团与水的有效结合，使得米蛋白的水合能力因蛋白质间相互作用的增强而降低，反之，却提高了米蛋白的持油能力。

图5 微波对米蛋白持水性和持油性的影响(n=3)

3 结论

本研究表明，在单位体积微波功率750 W/L条件下，随着微波处理时间(0.2、3.1、5.6、7.2 和 8.6 min)的延长，微波辅助碱法制备无毒米蛋白的回收率及纯度的变化不显著，溶解性、起泡性和持油性显著提高，起泡稳定性、乳化性及乳化稳定性先提高后下降，而持水性呈下降趋势。因此在确保米蛋白安全无毒的前提下，微波辅助碱法降解AFB1优化工艺对米蛋白品质有一定的影响，并且总体上呈现较好的趋势，但该工艺对米蛋白结构的影响有待于进一步研究，从结构层面上深入分析其对米蛋白品质的影响。

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