柴黄片血清药物化学的初步研究

张美玲赵 萃梁现蕊蔡钟钦

1浙江省立同德医院药学部 杭州 310012 2浙江省中医药研究院3浙江工业大学药学院 绿色制药技术与装备教育部重点实验室

柴黄片血清药物化学的初步研究

张美玲1，2赵 萃3梁现蕊3蔡钟钦1，2

1浙江省立同德医院药学部 杭州 310012 2浙江省中医药研究院3浙江工业大学药学院 绿色制药技术与装备教育部重点实验室

目的 通过对柴黄片血清药物化学研究方法的建立，探讨柴黄片口服吸收后的入血成分。方法 采用血清药物化学研究方法，在建立柴黄片超高效液相色谱（UPLC）特征图谱的基础上，通过比较柴黄片原药、柴胡给药后含药血清、黄芩给药后含药血清、柴黄片给药后含药血清、空白血清UPLC特征图谱，鉴定柴黄片口服给药后的血中移行成分。结果 口服柴黄片后，从血清中发现20个入血成分，其中6个为柴黄片中原型吸收入血的成分，其余入血成分可能为原型成分的代谢产物。结论 20个入血成分可能是柴黄片的体内直接作用物质，对其进行深入研究将有助于为柴黄片的药效物质基础及药效机制奠定基础。

柴黄片；超高效液相；入血成分；特征图谱

中药血清药物化学是基于中药体内直接作用物质的形成过程及中药有效成分体内过程的研究提出发展起来的。中药血清药物化学在全面分析方剂中血中移行成分、确定方剂药效物质基础上，通过主要药效成分的体内动态、成分间相互作用及消长规律的研究，在一定程度上解决中药的药效物质基础及作用机制问题，科学地诠释方剂的配伍规律，能使中医药的理论及实践实现实质性的进步和发展[1]。柴黄片收载于2010年版《中国药典》第一部，由柴胡、黄芩两味中药按1：1配比经现代工艺加工制备而成，具有清热解表的功效；本研究首次采用血清药物化学方法研究柴黄片进入血液后的原形药物及其代谢产物的存在状况及谱效关系，逆向追溯柴黄片有效活性物质，以诠释柴胡、黄芩药对配伍应用的原理与规律。

1 实验材料

1.1 动 物 健康成年SD大鼠20只，雌雄各半，平均体质量（220±20）g，均为清洁级动物，检疫合格。购自浙江大学动物实验中心，许可证号：SYXK（浙）2012-0178。

1.2 仪 器 超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）是由 Waters Acquity系统，二元溶液输送泵，自动取样器，二极管阵列检测器组成，并与Waters Empower软件相连；低温冷冻高速离心机（eppendorf centrifuge 5810R）。

1.3 药品与试剂 柴胡、黄芩（杭州华东中药饮片有限公司）；柴黄片（四川百利药业有限责任公司,每片含生药量2g，批号120801）；黄芩素标准品（纯度≥98.5%，批号111595～200905）、汉黄芩素标准品（纯度≥98%，批号111514～200403）和黄芩苷标准品（纯度≥91.7%，批号110715～201117）、柴胡皂苷a（纯度≥90.5%，批号110777-201108）、柴胡皂苷d（纯度≥94.6%，批号110778-201208）（中国食品药品检定研究所）；汉黄芩苷标准品（纯度≥99%，批号130225）（上海友思生物技术有限公司）；HPLC级的乙腈和甲醇（默克公司）；其他所有分析级的化学品（天津永大化学试剂有限公司）；超纯水由Barnstead TII超级纯水系统制备。

2 实验方法

2.1 对照品溶液制备 精密称取黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素对照品适量置深色容量瓶中，加适量甲醇溶解并稀释，制成浓度为0.5mg/mL的储备液，备用。

2.2 柴黄片供试品溶液制备 取柴黄片10片，糖衣片去除糖衣，研细，取约0.5g（相当于生药2g），精密称定，置100mL量瓶中，加70%乙醇80mL，超声处理45min，放冷，加70%乙醇至刻度，摇匀，滤过。精密量取滤液5mL置20mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即为供试品溶液。

2.3 柴胡、黄芩、柴黄片灌胃液制备 取柴胡、黄芩各200g，分别加适量水煎煮2次，第一次2h，第二次1h，合并煎煮液；煎煮液分别浓缩，制成浓度为2.85g/ mL的柴胡灌胃液（总量70mL），浓度为1.66g/mL的黄芩灌胃液（总量120mL）。取柴黄片25片（每片含生药量2g），除糖衣，碾碎用适量蒸馏水混合，制成浓度为1.67g/mL的灌胃液（总量30mL）。

2.4 含药血清、空白血清的制备 取Wistar大鼠20只随机进行编号并分为空白组、柴胡组、黄芩组、柴黄片组，各5只。分笼饲养，禁食12h（自由饮水），按照大鼠体质量（25g生药量/kg）给药[2]，于每天早上8点、晚上8点分别灌胃（空白组给予蒸馏水3mL/ 200g、柴黄片组给予柴黄片灌胃液3mL/200g、柴胡组给予柴胡提取液1.8mL/200g、黄芩组给予黄芩提取液3mL/200g），给药3天后，分别于末次给药30min、1h、2h后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，无菌下腹主动脉取血5mL，置无菌试管中，3000r/min条件下离心10min，取上清液加入0.2mL 70%高氯酸，涡旋振荡15s后以10 000r/min转速离心10min，上层清液经0.22μm微孔滤膜过滤，即得[3]。

2.5 UPLC分析

2.5.1 色谱条件 色谱分离方法：使用Waters Acquity BEH C18柱，50×2.1mm，1.7μm。流动相由A（0.1%磷酸，pH2.2）and B（乙腈）组成，其梯度洗脱的程序如下：0～11min，15%～45%B；11～12min，45%B，流速为0.2mL/min，柱温30℃，检测波长设为276nm。

2.5.2 稳定性检测 按照“2.2”提取并制备柴黄片样品溶液，采用“2.5”UPLC条件分别在0、2、4、6、8、10h进样（分别标记为1号、2号、3号、4号、5号 、6号），计算黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素在276nm和 203nm波长下的保留时间 RSD均＜0.281%，说明样品溶液日内基本稳定。见表1、2。

表1 稳定性试验结果（203nm）

表2 稳定性试验结果（276nm）

2.5.3 重复性检测 按照“2.2”提取并制备柴黄片样品溶液6份（分别标记为1号、2号、3号、4号、5号、6号），采用“3.1”UPLC条件测定，计算黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素在276nm和203nm波长下的保留时间RSD均＜0.197%，说明制备样品溶液的重现性较好。见表3、4。

表3 重复性试验结果（203nm）

表4 重复性试验结果（276nm）

2.6 分析方法 分别取各对照品溶液、柴黄片提取物、柴胡给药后血清、黄芩给药后血清、柴黄片给药后血清、空白血清等样品，在相同的UPLC色谱条件下进行分析，建立UPLC图，根据色谱峰保留时间、紫外特征光谱和对照品信息，比较确定柴黄片血中移行成分。

3 实验结果

3.1 柴黄片化学成分分析 柴黄片和柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素各标准品的UPLC图,见图1～2，通过对比保留时间及各峰的紫外吸收，明确柴黄片中11号峰为黄芩中的黄芩苷，18号峰为黄芩中的汉黄芩苷，19号峰为黄芩中的黄芩素，20号峰为为黄芩中的汉黄芩素；柴胡皂苷a和柴胡皂苷d未在柴黄片中检测出；其余12、13、14、15、21号峰为黄芩或柴胡的其他成分。

3.2 柴黄片血中移行成分分析 柴黄片含药血清中共检测到20个血中移行成分，其中11、13、15、18、19、20为柴黄片中原型成分移行入血；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17号峰是体内代谢成分。通过比对柴胡给药后血清、黄芩给药后血清保留时间及各峰的紫外吸收，推测1、7、8、9、10、16、17号峰为黄芩体内代谢成分，而2、3、4、5、6、12、14号峰是柴胡与黄芩在体内相互作用后的产物。柴胡、黄芩及柴黄片的含药血清UPLC见图3～5。

图1 柴胡皂苷标准品和柴黄片UPLC图（203nm）；a柴胡皂苷a标准品；b柴胡皂苷d标准品；c柴黄片

图2 黄芩标准品和柴黄片UPLC图（276nm）；a黄芩苷标准品；b汉黄芩苷标准品；c黄芩素标准品；d汉黄芩素标准品；e柴黄片

4 讨论

柴黄片收载于2010年版《中国药典》，具有清热解表的功效，用于风热感冒引起的发热、周身不适、头痛目眩、咽喉肿痛等症，药理研究表明其具有解热、抗菌、抗过敏、保肝利胆等作用。柴胡、黄芩均始载于东汉《神农本草经》，柴胡具有解表退热、疏肝解郁、升举阳气之功，其主要有效成分为柴胡皂苷、植物甾醇、侧金盏花醇等；近十年来分离鉴定的皂苷有四十余种，其中报道最多的是柴胡皂苷a、柴胡皂苷b和柴胡皂苷d。黄芩有清热燥湿、泻火解毒、凉血止血、除热安胎的功能，含有多种黄酮类化合物其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等为黄芩的特征化学成分。柴胡、黄芩中含有的主要成分黄酮类最大吸收波长在276nm左右[4]，皂苷类最大吸收波长在203nm[5]。为了获得最佳的检测波长，实验中用检测器对200～700nm波长范围进行了扫描，重点考察203nm、276nm和330nm这三个波长。

图3 柴黄片大鼠给药前后UPLC图（276nm）；a空白血清；b柴黄片；c柴黄片给药后血清

图4 柴胡、黄芩、柴黄片大鼠给药后UPLC图（203nm）；a空白血清；b柴胡给药后血清；c黄芩给药后血清；d柴黄片给药后血清

图5 柴胡、黄芩、柴黄片大鼠给药后UPLC图（276nm）；a空白血清；b柴胡给药后血清；c黄芩给药后血清；d柴黄片给药后血清

柴胡中柴胡皂苷a、d在提取过程中易受酚类或酸类成分影响转化为皂苷b1、b2，故需采用弱碱性溶剂提取，根据文献报道用5%氨水-甲醇进行超声提取或闪式提取效率高、易于检测到相应成分[6]，本实验中采用5%氨水-甲醇对柴胡生药进行提取后成功检测到柴胡皂苷a、d成分，但柴胡提取液和柴黄片的检测中没有出现柴胡皂苷a、d的峰值，提示单纯的煎煮法及片剂的生产工艺中柴胡皂苷a、d已受影响。

中药复方成分复杂，其进入体内后又经历一系列的生物转化过程，有些成分以原形入血，有些成分转化为其代谢产物，有些成分则直接作用于体内靶点，使其分泌生理活性物质，致使进入血中的成分与体外相比会发生很大变化。本研究发现，柴黄片含药血清与体外图谱相比，含药血清中共有14个新增色谱峰；14个色谱峰中，有7个峰的保留位置与黄芩含药血清色谱峰相一致，基本可认定为黄芩体内代谢成分，而另7个既非正常大鼠血清中生理活性成分，也不是柴胡体内代谢成分，推测为黄芩与柴胡相互作用后进入血中的产物，或是药物作用大鼠而产生的内源性活性物质，有待于进一步的研究。

本实验首次采用超高效液相色谱法对柴黄片血中移行成分进行分析，建立的方法显示了良好的灵敏度、准确度、精确度、线性、稳定性和回收率，能够全面反映柴黄片口服后吸收入血的药物成分，为确定柴黄片药效物质基础及代谢研究奠定基础。

［1］柯玮，朱建华.中药血清药理方法学的研究概况［J］.中国中医药指南，2011，9（6）：24-25.

［2］王喜军，张宁，曹洪欣，等.复方安替威胶囊大鼠血清药物化学的初步研究［J］.中国中药杂志，2006，31（18）：1538-1540.

［3］郑林，陈慧，王爱民，等.超高效液相色谱测定大鼠口服荭草花后入血成分［J］.中国医院药学杂志，2012，32（2）：91-93.

［4］陈平平，董婉茹，曹敏，等.黄芩血清药物化学的初步研究［J］.中医药信息，2010，27（5）：32-34.

［5］刘金欣，孟繁蕴，魏英勤，等.UPLC-ELSD同时测定北柴胡中柴胡皂苷a、c、d的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（5）：83-86.

［6］汤芳玲，付珣，朱珍真，等.UPLC法测定小叶黑柴胡的根中柴胡皂苷a、d含量［J］.药物分析杂志，2011，31（9）：1654-1657.

Preliminary Study on Serum Pharmacochemistry of Chaihuang Tablets

ZHANG Meiling1，2,ZHAO Cui3,LIANG Xianrui3,CAI zhongqin1，2. 1.Department of Pharmacy,Zhejiang Provincial TongdeHospital,Hangzhou（310012）,China;2.Traditional Chinese Medicine Academy of Zhejiang;3.Ministry of Education Key Laboratory of Green Pharmaceutical Technology and Equipment,College of Pharmaceutical Sciences,Zhejiang University of Technology.

Objective To explore the bioactive constituents of Chaihuang tablets by serum pharmacochemistry method.Methods Ultra performance liquid chromatography fingerprints of Chaihuang tablets were established.The blood migrating constituents of Chaihuang tablets were determined by comparing the UPLC fingerprints of Chaihuang tablets,Chaihuang-contained serum samples,Chaihu-contained serum samples,Huangqin-contained serum samples,and blank serum samples.Results Twenty compounds absorbed into the blood were detected,of which 6 were original constituents of Chaihuang tablets and the rest might be metabolites of the original ones.Conclusion The 20 constituents absorbed in the blood might be the bioactive components of Chaihuang tablets.Further studies on them would be useful to clarify the bioactive constituents and mechanism of action of Chaihuang tablets.

Chaihuang tablets；ultra performance liquid chromatography；absorbed constituents in the blood；fingerprints

2014-06-24

修回日期：2014-07-29

浙江省公益性技术应用研究（分析测试）计划项目（No.2012C37043）

张美玲，Tel：（0571）89972240；E-mail：zml9998@sina.com